[發明專利]一種利用籠狀植物鐵蛋白同時提高疏水性及水溶性活性成分穩定性的方法和應用

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• 申請號: 202010012294.5
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111150063A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 楊瑞;陳盛楠;孟德梅;石麗娜;周中凱
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: A23L33/105
• 分類號: A23L33/105;A23L29/00;A23P10/30
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種利用籠狀植物鐵蛋白同時提高疏水性及水溶性活性成分穩定性的方法，其特征在于：步驟如下：

將水溶性活性成分溶于pH6.70-6.90的去離子水中制備母液，該母液中水溶性活性成分的濃度為3.0mM，將疏水性活性成分溶于濃度為90％-95％的乙醇中制得母液，該母液中疏水性活性成分的濃度為2.5mM；利用1M的HCl調節鐵蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使鐵蛋白變性解離為亞基狀態，將水溶性活性成分添加到變性的鐵蛋白溶液中，使水溶性活性成分：鐵蛋白的摩爾比為120：1，然后將制得的溶液在25℃下攪拌10-20min，并隨后孵育90-120min，使混合物均勻化；隨后往該體系中添加1M的NaOH溶液并調節鐵蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分攪拌溶液使之混合均勻，并靜置30min，目的是使鐵蛋白復性并誘導水溶性活性成分包埋于鐵蛋白中；

使用水浴加熱，誘導以上獲得的鐵蛋白-水溶性活性成分復合物溫度升高至44-46℃，并維持20-30min，誘使鐵蛋白的通道擴張，隨后將疏水性活性成分母液稀釋后添加到該體系中，使疏水性活性成分：鐵蛋白的摩爾比為120：1，繼續維持至44-46℃條件20-30min，并攪拌，誘導疏水性活性成分通過通道進入鐵蛋白空腔內部，形成三組分復合物；以8000-9000rpm離心20min澄清樣品，收集上清液，即得鐵蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分復合物，該復合物中疏水性及水溶性活性成分的穩定性均得到提高。

2.根據權利要求1所述的利用籠狀植物鐵蛋白同時提高疏水性及水溶性活性成分穩定性的方法，其特征在于：具體步驟如下：

⑴利用紅豆為原料，將紅豆種子置于4℃蒸餾水中浸泡過夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2-3倍體積含有質量濃度為1％-2％聚乙烯吡咯烷酮的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄溶液，該溶液的pH為7.0，并用內切式勻漿機勻漿3次，每次2-3min，200目濾網濾去豆渣，將收集的勻漿于6000g、4℃下離心10-15分鐘，棄沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入終濃度為50-100mM的MgCl₂晶體，溶解后立即4500-5000g離心5-10min，棄沉淀，得上清液；上清液靜置20-30min后，加入終濃度為70-100mM的檸檬酸三鈉晶體，靜置6-24h，經10000-12000g離心20-30min后，得沉淀和離心后上清液，沉淀即為紅豆鐵蛋白，該鐵蛋白不復溶于該離心后上清液；

⑶在離心獲得的沉淀中加入其1.5-3倍體積的離心后上清液，沖洗沉淀中的淀粉和核糖體，然后10000g離心5-10min，棄上清，重復1至兩次以上，直至只有褐色沉淀；

⑷將褐色沉淀溶于1.5倍體積蒸餾水中，10000g離心5-10min，棄上清；重復兩次用5倍體積蒸餾水溶解沉淀，13000g離心5-10min，收集并合并上清液，獲得紅豆鐵蛋白，該紅豆鐵蛋白的濃度為1.0-2.0μM，其pH值為6.5-7.0；將獲得的紅豆鐵蛋白放入透析袋，置于pH8.0-8.5的50mM Tris-HCl緩沖液中，然后使用質量濃度為1-2％連二亞硫酸鈉溶液不斷透析還原鐵蛋白，直到鐵蛋白中的Fe³⁺逐步還原為Fe²⁺，被透析除去，再加入1-2mM 2,2’-聯吡啶螯合去掉鐵蛋白外殼上吸附的鐵離子，最后用pH 7.5-7.9的50mM MOPS緩沖液把2,2’-聯吡啶透析除去，獲得脫鐵紅豆鐵蛋白，下一步備用；

⑸采用鐵蛋白的可逆自組裝性和鐵蛋白受熱引發的通道尺寸增大效應分別進行兩種組分的包埋，即進行水溶性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG和疏水性的槲皮素的包埋：

首先將EGCG溶于pH6.70-6.90的去離子水中制備母液，該母液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的濃度為3.0mM，將槲皮素溶于濃度為3.0mM的乙醇中制得母液，該母液中槲皮素的濃度為2.5mM；利用1M的HCl調節脫鐵紅豆鐵蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使脫鐵紅豆鐵蛋白變性解離為亞基狀態，將EGCG添加到變性的脫鐵紅豆鐵蛋白溶液中，使EGCG：脫鐵紅豆鐵蛋白的摩爾比為120：1，然后將制得的溶液在25℃下攪拌10min，并隨后孵育90min，使混合物均勻化；隨后往該體系中添加1M的NaOH溶液并調節脫鐵紅豆鐵蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分攪拌溶液使之混合均勻，并靜置20-30min，目的是誘導脫鐵紅豆鐵蛋白復性并誘導EGCG包埋于脫鐵紅豆鐵蛋白中；

使用水浴加熱，誘導以上獲得的脫鐵紅豆鐵蛋白-EGCG復合物溫度升高至44-46℃，并維持20-30min，使脫鐵紅豆鐵蛋白的通道擴張，隨后將槲皮素母液稀釋后添加到該體系中，稀釋液為90％-95％濃度乙醇，使槲皮素：脫鐵紅豆鐵蛋白的摩爾比為120：1，繼續維持至44-46℃條件20-30min，并攪拌，誘導槲皮素進入脫鐵紅豆鐵蛋白空腔內部，形成三組分復合物；以8000-9000rpm離心20min澄清樣品，收集上清液，即得鐵蛋白-EGCG-槲皮素復合物，該復合物中疏水性及水溶性活性成分的穩定性均得到提高。

3.如權利要求1或2所述的利用籠狀植物鐵蛋白同時提高疏水性及水溶性活性成分穩定性的方法制得的鐵蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分復合物在食品方面中的應用。