[發明專利]β-呋喃果糖苷酶突變體、突變基因及其在制備維生素B12

有效

• 申請號: 202010012144.4
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN110904079B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 張大偉;董會娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/74;C12P19/42;C12N13/00;C12N1/20;C12R1/41
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開一種β?呋喃果糖苷酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。在苜蓿中華根瘤菌中過表達的β?呋喃果糖苷酶基因和突變基因的基因工程菌，其生產維生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有較大的應用推廣價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及β-呋喃果糖苷酶突變體、突變基因，及其在制備維生素B₁₂中的應用。

背景技術

維生素 B₁₂ (VB₁₂)在藥物和食品工業中具有廣泛的應用，其又叫鈷胺素，屬于咕啉類化合物，是唯一含金屬元素的維生素類化合物，是B族維生素發現最晚的大分子有機化合物。根據咕啉環上方的配基（R基團）種類不同，維生素B₁₂可分為：羥基鈷胺素，脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。維生素B₁₂參與了大量的生化反應過程包括DNA的合成和調控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能力的產生。

由于維生素B₁₂分子結構復雜，化學法人工合成需要消耗大量的人力與物力，而且合成周期長。在合成過程中對操作人員的要求過高，導致不能大量的生產。微生物發酵法目前是生產維生素B₁₂的最廉價的方法，能夠大量生產并推廣其使用。

目前，國內外針對維生素B₁₂生產菌生物合成維生素B₁₂的研究主要集中在發酵過程優化，主要涉及培養基包括碳氮源和金屬離子的優化、甜菜堿的添加、魚藤酮的添加，工藝條件包括pH和供氧的控制等。有文獻報道通過在脫氮假單胞菌基因組上表達單拷貝的透明顫菌vgb 基因來增加細胞生產維生素B₁₂的能力（程立芳等, 不同來源的尿卟啉原 III轉甲基酶在脫氮假單胞菌中的表達及其對生產維生素 B12 的影響. 工業微生物，2017，第47 卷第 3期）。

本發明人前期篩選出了一株高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可發酵生產維生素B₁₂。

β-呋喃果糖苷酶的作用機理是將蔗糖的葡萄糖基與果糖基的β-(1, 4)糖苷鍵斷裂，生成果糖與葡萄糖。果糖與葡萄糖隨后進入糖酵解途徑。目前，尚未有β-呋喃果糖苷酶cscA用于維生素B₁₂合成的報道。

發明內容

本發明人對前期篩選出的高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），通過對其進行誘變，獲得一株產維生素B₁₂能力提高的誘變菌株。本發明作了進一步研究以發現對產維生素B₁₂能力有影響的基因。經過研究發現一種發現β-呋喃果糖苷酶基因和其突變基因，其導入苜蓿中華根瘤菌中過表達，能夠提高所述菌的產維生素B₁₂的能力。

本發明首先提供一種β-呋喃果糖苷酶的突變體，其多肽氨基酸序列相對于如SEQID No.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替換為T，和/或第330位氨基酸替換為L。

更具體地，其多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：5或6所示。

進一步地，本發明提供上述的β-呋喃果糖苷酶的突變體的編碼基因。

更具體地，所述核苷酸酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

本發明尤其提供β-呋喃果糖苷酶編碼基因在制備維生素B₁₂中的應用。

在具體實施方式中，其是通過含有所述編碼基因的表達載體導入苜蓿中華根瘤菌中進行過表達。進一步地，所述導入的編碼基因位于質粒或染色體中。