[發明專利]前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶突變體、突變基因及其在制備維生素B12

有效

• 申請號: 202010012115.8
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN110804598B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 張大偉;董會娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/74;C12P19/42
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開一種前咕啉?2C(20)?甲基轉移酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。在苜蓿中華根瘤菌中過表達的前咕啉?2C(20)?甲基轉移酶基因和突變基因的基因工程菌，其生產維生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有較大的應用推廣價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。

背景技術

維生素 B₁₂ (VB₁₂)在藥物和食品工業中具有廣泛的應用，其又叫鈷胺素，屬于咕啉類化合物，是唯一含金屬元素的維生素類化合物，是B族維生素發現最晚的大分子有機化合物。根據咕啉環上方的配基（R基團）種類不同，維生素B₁₂可分為：羥基鈷胺素，脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。維生素B₁₂參與了大量的生化反應過程包括DNA的合成和調控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能力的產生。

由于維生素B₁₂分子結構復雜，化學法人工合成需要消耗大量的人力與物力，而且合成周期長。在合成過程中對操作人員的要求過高，導致不能大量的生產。微生物發酵法目前是生產維生素B₁₂的最廉價的方法，能夠大量生產并推廣其使用。

目前，國內外針對維生素B₁₂生產菌生物合成維生素B₁₂的研究主要集中在發酵過程優化，主要涉及培養基包括碳氮源和金屬離子的優化、甜菜堿的添加、魚藤酮的添加，工藝條件包括pH和供氧的控制等。有文獻報道通過在脫氮假單胞菌基因組上表達單拷貝的透明顫菌vgb 基因來增加細胞生產維生素B₁₂的能力（程立芳等, 不同來源的尿卟啉原 III轉甲基酶在脫氮假單胞菌中的表達及其對生產維生素 B12 的影響. 工業微生物，2017，第47 卷第 3期）。

本發明人前期篩選出了一株高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可發酵生產維生素B₁₂。在苜蓿中華根瘤菌中，前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶(precorrin-2C(20)-methyltransferase)將前咕啉-2(precorrin-2)轉化為前咕啉-3A(precorrin-3A)，該酶是由尿卟啉原Ⅲ到前咕啉-6(precorrin-6)的生物合成途徑的第二個酶，其編碼基因cobI基因是操縱子cobFGHIJKLM的第四個基因（Huan Fang, Jie Kang,Dawei Zhang*. Microbial production of vitamin B12: A review and futureperspectives. Microbial Cell Factories. 2017 Jan 30; 16(1):15. doi: 10.1186/s12934- 017-0631-y.）。目前，尚未有前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶突變基因cobI用于維生素B₁₂合成的報道。

發明內容

本發明人對前期篩選出的高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），通過對其進行誘變，獲得一株產維生素B₁₂能力提高的誘變菌株。本發明作了進一步研究以發現對產維生素B₁₂能力有影響的基因。經過研究發現一種前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶編碼基因，其導入苜蓿中華根瘤菌中過表達，能夠提高所述菌的產維生素B₁₂的能力。

首先，本發明提供一種前咕啉-2C(20)-甲基轉移酶的突變體，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.4所示原始序列的基礎上具有下述突變：第104位氨基酸替換為A，和/或第126位氨基酸替換為F。