[發(fā)明專利]一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的制備方法及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010010507.0 | 申請日： | 2020-01-06 |
| 公開（公告）號： | CN111004792A | 公開（公告）日： | 2020-04-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 袁輝;陳煒山 | 申請（專利權(quán)）人： | 陳煒山 |
| 主分類號： | C12N9/42 | 分類號： | C12N9/42;A61K8/66;A61Q19/00 |
| 代理公司： | 深圳市蘭鋒知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44419 | 代理人： | 劉小芹 |
| 地址： | 518000 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 耐受 葡萄 糖苷酶 制備 方法 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，從棘孢曲霉中分離所述的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，包括以下步驟：
S1、將選取的棘孢曲霉接入PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，蒸餾水1000ml稀釋）進行活化培養(yǎng)3d，活化培養(yǎng)的環(huán)境溫度保持在28℃±2℃；
S2、將活化培養(yǎng)后的棘孢曲霉放至搖床內(nèi)進行發(fā)酵搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間8d，搖床培養(yǎng)的環(huán)境溫度保持在26℃±2℃；
S3、將發(fā)酵搖床培養(yǎng)的棘孢曲霉菌株轉(zhuǎn)接入1000mL三角瓶，28℃的培育環(huán)境下，220r/min下液體發(fā)酵培養(yǎng)36h，按1％接種量接入50L發(fā)酵罐，在200r/min、pH7.0、通氣量0.7vvm條件下，培養(yǎng)36h后，再按10v/v％接種量轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐，在220r/min，pH7.0，通氣量0.7-1.2vvm下，培養(yǎng)3d；
S4、取發(fā)酵階段的棘孢曲霉發(fā)酵液40ml在4℃、10000g條件下離心10min，棄上清液，收集菌體；
將發(fā)酵培養(yǎng)液進行檢測，將裝有菌懸液的離心管置于冰浴中，實施超聲波破碎；
破碎的細胞溶液在4℃、5000g環(huán)境條件下離心15min，去除不溶性細胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞內(nèi)粗酶液；
S5、從棘孢曲霉胞內(nèi)粗酶液中提取蛋白質(zhì)，使用pH值為4.8～5.0的物質(zhì)的量濃度為18～22mM的醋酸-醋酸鈉溶液，以0.15～0.3mL/min沖洗分子篩凝膠層析柱，隨后對提取的蛋白質(zhì)使用DEAE-陰離子交換柱層析進行分離，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，備用；
S6、將正硅酸乙酯與水混合，其中正硅酸乙酯與水的比例為1：500，混合均勻后加入鹽酸攪拌，將溫度升至55-65℃回流1-2h，之后冷卻至室溫，得到反應(yīng)混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低溫靜置下凝膠化，得到固定化β-葡萄糖苷酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，所述S4中使用的檢測方法為將發(fā)酵培養(yǎng)液于3000r/min離心10min，得上清粗酶液，用微量進樣器取0.1mL適度稀釋的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L檸檬酸緩沖液,于50℃恒溫水浴預(yù)熱5～10min,再加入已預(yù)熱5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精確計時,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，室溫放置5min，于4420nm處測光吸收值OD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，所述S6中的正硅酸乙酯與水的摩爾比為1:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于，所述高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高溫，耐質(zhì)量濃度4-6％的氯化鈉，耐質(zhì)量分數(shù)3％醋酸和體積分數(shù)11％以上的酒精。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于，所述S4中的超聲波破碎條件為：超聲儀探頭置于液面下1cm，功率455W，超聲時間4s，工作間隔為4s，工作總時間為30min，工作環(huán)境溫度為0-4℃。
6.一種高耐受型β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于，所述固定化β-葡萄糖苷酶在使用時，進行去凝膠化處理后，可以配制化妝品保濕精華液，包括以下步驟：
S1、將固定化β-葡萄糖苷酶進行去凝膠化處理，得到β-葡萄糖苷酶液；
S2、選取占比為15％蘆薈，1.5％酒精提取液, 0.2％透明質(zhì)酸,其余占比的去離子水,分別添加DEAE層析后0.25氯化鈉梯度洗脫的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,將混合液靜置40天,靜置的環(huán)境溫度在45-55℃；
S3、將靜置好的混合液冷卻2-3d，分裝裝瓶，制得保濕精華液成品。
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