[發明專利]一種一管檢測血漿游離DNA中KRAS和BRAF基因突變的試劑盒

有效

• 申請號: 202010009798.1
• 申請日: 2020-01-06
• 公開（公告）號: CN110964833B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 張偉;付亞成;鄔麟
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發明涉及一種一管檢測血漿游離DNA中KRAS和BRAF基因突變的試劑盒，屬于分子生物學技術領域。本發明所述試劑盒包括：KRAS?G12S?F、KRAS?G12R?F、KRAS?G12C?F、KRAS?G12S?R、KRAS?G12D?R、KRAS?G12A?R、KRAS?G12V?R、KRAS?G12D?F、KRAS?Probe1、KRAS?Probe2、KRAS?Blocker1、BRAF?V600?F、BRAF?V600?R和BRAF?Probe。本發明試劑盒能夠一管同時對外周血游離DNA樣本中的人KRAS基因和BRAF基因突變進行快速檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種一管能檢測人類血漿游離DNA中KRAS基因7個熱點突變和BRAF基因1個熱點突變的的引物及其試劑盒。

背景技術

RAS基因家族與人類腫瘤密切相關的基因有三種HRAS、KRAS和NRAS，這三種基因編碼的蛋白質大約有90％的氨基酸序列同源，分子量均為21KDa，又稱為RASp21蛋白。KRAS信號通路是EGFR和其他信號轉導的下游通路，當RAS基因發生突變時，其編碼的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信號轉導通路一直處于持續激活狀態，剌激細胞不斷增殖分化，最終導致細胞惡變。

KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號通路的調控。KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因，其最常見的突變位點主要在2號外顯子的第12、13密碼子以及3號外顯子的第61位密碼子上。其中，第12、13密碼子突變頻率較高，占90％以上。KRAS基因處于EGFR信號傳導的下游通路，調控EGFR的活化狀態，起到“分子開關”的作用，當KRAS基因發生激活突變后，將促使腫瘤細胞不受控制地增殖，最終導致靶向藥物失去對EGFR的抑制作用。

BRAF基因，全名鼠類肉瘤濾過性毒菌(V-Raf)致癌同源體B1，位于人染色體7q34，包含18個外顯子，編碼蛋白質分子全長約94Kd。BRAF基因屬于RAF基因家族，同屬于RAF基因家族的，還有ARAF(基因)和CRAF(基因)。雖然ARAF和CRAF這兩個基因，和BRAF同屬于RAF基因家族，但是，在腫瘤病例當中，很少發現有ARAF和CRAF的基因突變。統計數據表明：在腫瘤病例當中，ARAF和CRAF的突變比例都不高于1％。

BRAF基因編碼的BRAF蛋白是一個絲氨基、酪氨酸激酶。主要有三個保守區，分別是CR1、CR2和CR3。其中CR3區為激酶的結構域，含甘氨酸環，是ATP的結合位點和主要激活區域，而且這區域的兩個位點T598和S601的磷酸化對激活BRAF蛋白起著至關重要的作用。幾乎BRAF基因上所有的突變都處于激酶結構域，主要是第600位密碼子產生突變，包括V600E、V600K、V600R、V600D、V600M和V600L等，另外還有1798_1799ins、1799_1801del等。BRAF突變后，上述信號通路被持續激活，從而引起細胞的異常增殖分化。在惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等癌癥中均發現不同比例的BRAF突變，其中BRAF突變在惡性黑色素瘤中約有60％，在乳頭狀甲狀腺癌中約44％，在結直腸癌中約5-15％。研究發現大約80～90％的BRAF基因突變發生在第15號外顯子的1799核苷酸上，T突變為A，導致其編碼谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。臨床研究發現，在結直腸癌中，BRAF突變對EGFR靶向藥物治療耐藥。同時，BRAF激酶抑制劑用于治療攜帶BRAF?V600E突變的黑色素瘤患者效果更好。此外，BRAF基因突變檢測可作為甲狀腺癌患者診斷的一項重要指標。大量研究表明BRAF基因突變作為乳頭狀甲狀腺癌(PTC)發生的驅動性突變，已經成為乳頭狀甲狀腺癌細針穿刺細胞學標本診斷和病情預后的一個重要指標。因此，對BRAF基因突變的檢測，可以為腫瘤患者的個體化治療提供更確切的依據。