[發(fā)明專利]用于檢測(cè)去泛素化酶的納米熒光探針的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010008428.6
• 申請(qǐng)日: 2020-01-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111154481B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王粵博;梁妍妍;王懷松;崔輝;艾兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 淄博啟智達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 37280
• 代理人: 任永哲

本發(fā)明屬于去泛素化酶熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)去泛素化酶的納米熒光探針的制備方法。將介孔硅納米顆粒分散在含有菲啰啉?硅的二氯甲烷溶液中反應(yīng)，得到介孔硅?菲啰啉納米顆粒；介孔硅?菲啰啉納米顆粒與TbCl₃·6H₂O在乙醇中混合，回流，加入1,3?二苯基?1,3?丙二酮反應(yīng)，得到納米熒光探針前驅(qū)體；將納米熒光探針前驅(qū)體懸浮在聚乙烯亞胺水溶液中進(jìn)行聚乙烯亞胺涂覆，得到聚乙烯亞胺改性的納米熒光探針前驅(qū)體；聚乙烯亞胺改性的納米熒光探針前驅(qū)體分散在混合溶液中，攪拌，得到納米熒光探針。本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，周期短；制得的納米熒光探針對(duì)UCH?L1的檢測(cè)具有良好的靈敏度和選擇性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于去泛素化酶熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)去泛素化酶的納米熒光探針的制備方法。

背景技術(shù)

泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的小蛋白。泛素化是泛素在一系列特異性酶的作用下特異性修飾靶蛋白的過(guò)程，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性。在泛素化過(guò)程中，通過(guò)在泛素的C-末端和目標(biāo)蛋白的內(nèi)切酶之間形成等肽鍵而與目標(biāo)蛋白結(jié)合。去泛素化酶能催化肽鍵的水解，從而調(diào)節(jié)靶蛋白的泛素化狀態(tài)。所以泛素化可以通過(guò)去泛素化酶的作用來(lái)逆轉(zhuǎn)。一大類去泛素化酶調(diào)節(jié)這種細(xì)胞過(guò)程，并且在癌癥、傳染病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中起著重要作用。因此實(shí)現(xiàn)去泛素化酶的高靈敏度檢測(cè)對(duì)諸多疾病的預(yù)測(cè)和治療具有重要的科學(xué)意義。

為了監(jiān)測(cè)去泛素化酶的活性，研究者開(kāi)發(fā)了諸多方法，如質(zhì)譜、免疫印跡和光致發(fā)光。其中，發(fā)光檢測(cè)因其靈敏度高、實(shí)驗(yàn)方便而被證明是一種強(qiáng)有力的手段。

基于鑭系離子(Eu³⁺、Tb³⁺和其他配合物)的熒光探針在檢測(cè)陽(yáng)離子、陰離子和有機(jī)小分子方面表現(xiàn)出極好的靈敏度，它們有尖銳的發(fā)射帶和較大的斯托克位移。然而，由于競(jìng)爭(zhēng)配位作用，鑭系元素探針的熒光在水中和生物溶劑中很容易熄滅。鑭系元素傳感系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度也會(huì)受到配位環(huán)境的影響。限域效應(yīng)可以改變稀土配合物的振動(dòng)頻率，影響能量傳遞的類型。因此，適當(dāng)?shù)南抻驐l件可以防止熒光分子振動(dòng)，使能量主要以熒光信號(hào)的形式發(fā)射。目前，介孔二氧化硅納米顆粒易于控制尺寸限制，是構(gòu)建增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的受限環(huán)境的最佳材料。故如何構(gòu)建限域環(huán)境下熒光增強(qiáng)的高選擇性和靈敏度的納米探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)去泛素化酶的納米熒光探針的制備方法，制備方法簡(jiǎn)單，制備周期短，制得的納米熒光探針?lè)€(wěn)定性好，使用方便，具有高選擇性、較高的檢測(cè)靈敏度和較好的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明所述的用于檢測(cè)去泛素化酶的納米熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)將介孔硅納米顆粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反應(yīng)，得到介孔硅-菲啰啉納米顆粒；

(2)介孔硅-菲啰啉納米顆粒與TbCl₃·6H₂O在乙醇中混合，回流，加入1,3-二苯基-1,3-丙二酮反應(yīng)，得到納米熒光探針前驅(qū)體(MSN-Tb)；

(3)將納米熒光探針前驅(qū)體懸浮在聚乙烯亞胺水溶液中進(jìn)行聚乙烯亞胺涂覆，得到聚乙烯亞胺改性的納米熒光探針前驅(qū)體(MSN-Tb-PEI)；

(4)聚乙烯亞胺改性的納米熒光探針前驅(qū)體分散在混合溶液中，攪拌，得到納米熒光探針(MSN-Tb-UbR)；

步驟(4)中所述的混合溶液的制備方法是將EDC和NHS溶解在含有標(biāo)記有羅丹明B的泛素的磷酸緩沖液中，攪拌活化，得到混合溶液。

步驟(1)中所述的菲啰啉-硅的制備方法是1，10-菲啰啉-5-胺與異氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中攪拌，除去氯仿，將剩余的黃色粘性混合物攪拌反應(yīng)后，加入冷己烷，得到淺黃色沉淀，然后將淺黃色沉淀溶解在甲醇中并過(guò)濾，除去甲醇，并加入冷己烷重新沉淀，得到菲啰啉-硅。