[發明專利]利用BmIML-2基因篩選家蠶核型多角體病毒病抗性的方法

有效

• 申請號: 202010005619.7
• 申請日: 2020-01-03
• 公開（公告）號: CN111004852B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 趙巧玲;沈東旭;郭際云;佟美金;夏定國;裘智勇;沈興家
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發明公開了利用BmIML?2基因篩選家蠶核型多角體病毒病抗性的方法，所述方法在上蔟前最后一次給桑時添食核型多角體病毒，并以BmIML?2基因的轉錄水平為檢測指標，判斷家蠶對病毒的抗性強弱。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)本發明所述方法選擇5齡期上蔟前添毒，能夠縮短試驗周期，工作量小，且減少家蠶之間相互交叉感染的幾率；(2)本發明所述方法篩選后的家蠶品種對核型多角體病毒的抗性提高10?100倍；(3)本發明所述方法篩選后的家蠶品種經多代飼養抗性穩定，體質強健。

技術領域

本發明屬于家蠶良種選育技術領域，涉及一種采用基因工程方法選育家蠶抗病毒品種的技術，具體為利用BmIML-2基因篩選家蠶核型多角體病毒病抗性的方法。

背景技術

家蠶作為重要的經濟昆蟲和模式昆蟲，在科學研究、絲綢生產以及促進農民增收等方面意義重大。由家蠶核型多角體病毒引發的家蠶血液型膿病是蠶業生產上危害最為嚴重的蠶病，該病傳染性極強且難于防控，所造成的經濟損失占蠶病總損失的70％～80％。關于家蠶核型多角體病毒抗性品種的培育一直是業界重要的研究方向，家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因的篩選也是科研工作者培育家蠶抗性新品種的重要工作之一。傳統的篩選方法在家蠶2齡或3齡等幼蟲期進行病毒添食，該方法在蠶期容易污染家蠶飼養環境，造成家蠶之間的相互感染。

發明內容

解決的技術問題：為了克服現有技術的不足，本發明通過在上蔟前最后一次給桑時添食家蠶核型多角體病毒，并以免疫相關基因的轉錄水平為檢測指標來篩選對核型多角體病毒高抗性的品種；鑒于此，本發明提供了利用BmIML-2基因篩選家蠶核型多角體病毒病抗性的方法。

技術方案：利用BmIML-2基因篩選家蠶核型多角體病毒病抗性的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)選取至少一個家蠶品種為試驗材料并飼養至5齡期；采用核型多角體病毒溶液浸泡新鮮桑葉；

(2)待上蔟前最后一次給桑時，向每個品種的家蠶幼蟲添食步驟(1)的桑葉，然后繼續飼養直至上蔟結繭，期間淘汰病死蛹，發蛾后制種；

(3)取步驟(2)制種的蠶蛾，提取組織中的RNA并反轉錄為cDNA，根據BmIML-2基因全長序列設計引物，以cDNA為模板，通過RT-PCR檢測家蠶BmIML-2基因在每個家蠶品種中的轉錄水平差異；

(4)根據步驟(3)的RT-PCR檢測結果，篩選添食核型多角體病毒后BmIML-2基因轉錄水平顯著上調的品種及個體所產蠶卵留種繼代；

(5)重復步驟(1)至步驟(4)，對繼代的家蠶品種進行重復篩選6代以上，獲得家蠶核型多角體病毒病抗性品種。

優選的，步驟(1)中選取的家蠶品種為波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB和菁松。

優選的，步驟(1)中核型多角體病毒溶液的濃度為1×10⁶-5×10⁷個/mL。

優選的，步驟(3)中所述的引物序列為：

F(SEQ?ID?NO.1)：5’-AGAGTTCGTGTGGCATCTA-3’，

R(SEQ?ID?NO.2)：5’-ACCATATGAGAGGCAGGGTT-3’。

優選的，步驟(3)中所述組織為脂肪體。

優選的，步驟(3)中RT-PCR檢測的內參基因選用BmGAPDH基因。

優選的，驗證步驟(5)獲得的家蠶品種核型多角體病毒病抗性：將留種繼代的蠶卵催青、飼養至2齡起蠶，然后添食核型多角體病毒，繼續飼養至4齡起蠶后統計生存率。

優選的，以下家蠶品種：波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB對核型多角體病毒的抗性比菁松提高了10-100倍。