[發明專利]阪崎克羅諾桿菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應用

有效

• 申請號: 202010004056.X
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN110964788B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 曹永梅;李園園;李雪玲;劉偉;韋朝春;陸長德;李亦學;賈犇
• 申請（專利權）人: 上海旺旺食品集團有限公司;上海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對阪崎克羅諾桿菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增阪崎克羅諾桿菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在阪崎克羅諾桿菌。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610767389.1、發明名稱為：“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及應用”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)是一種革蘭氏陰性、周生鞭毛、能運動、無芽孢的兼性厭氧細菌，1980年前稱為非典型的產黃色素的陰溝腸桿菌，1980年后曾更名為阪崎腸桿菌，2008年重新分類命名，被劃歸于腸桿菌科克羅諾桿菌屬。阪崎克羅諾桿菌廣泛存在于自然界，是通過配方粉危害嬰幼兒健康的重要條件性致病菌，能引起嬰兒嚴重的臨床癥狀，如腦膿瘍，腦膜炎，壞死性小腸結腸炎和全身性敗血癥等，致死率高達40％-80％。新生嬰兒或早產兒都存在通過食用污染有阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方粉而感染阪崎克羅諾桿菌菌株的風險。與其他食源性致病微生物相比，雖然阪崎克羅諾桿菌感染率不高，但對于特殊人群卻有著較高的致死率，并且該菌的宿主及傳播模型尚并不是十分清楚。因此對于該菌的預防和檢測尤為重要。

目前，國內外針對阪崎克羅諾桿菌的檢測方法仍以常規培養方法作為標準，但檢測周期較長(達5-7天)，操作相對復雜，檢測效率較低，難以滿足現代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。隨后研究人員陸續開發出了PCR和熒光PCR技術的檢測手段，也被納入到我國的“奶粉中克羅諾桿菌的檢測方法”的行業標準，但是這兩種方法需要專門的檢測儀器，因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。