[發(fā)明專利]制備單鏈長探針的方法、去除核糖體RNA的方法和試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010001834.X
• 申請(qǐng)日: 2020-01-02
• 公開（公告）號(hào): CN113061646A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐沖;陳智超;韓默;阮鳳英;郭梅;楊林峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大基因科技服務(wù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/11;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 張立

本發(fā)明涉及一種制備單鏈長探針的方法、去除核糖體RNA的方法和試劑盒。該制備單鏈長探針的方法包括通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本包含核糖體RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；利用引物對(duì)cDNA樣本進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物能夠特異性靶向所述核糖體RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括互補(bǔ)的兩條鏈；去除擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條鏈，獲得所述單鏈長探針；所述引物包括第一引物和第二引物，第一引物5’端攜帶有磷酸化修飾，第二引物上含有至少一個(gè)硫代修飾。所獲得的單鏈長探針可以用于去除核糖體RNA，可以應(yīng)用于多種物種中RNA樣本中核糖體RNA的去除，方便簡單，且核糖體RNA的殘留率低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備單鏈長探針的方法、去除核糖體RNA的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

RNA在遺傳信息表達(dá)和調(diào)控過程中RNA發(fā)揮重要的作用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是研究生物調(diào)控的重要手段，其研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。非編碼RNA中核糖體RNA(rRNA)在總RNA中占據(jù)80％-90％，然而，這些rRNA所含的轉(zhuǎn)錄組信息很少，浪費(fèi)了寶貴的測(cè)序資源，也讓特定類型RNA的檢測(cè)變得困難。在二代測(cè)序的應(yīng)用中，研究者都希望從測(cè)序數(shù)據(jù)中最大化地接收有益的生物信息，一方面是因?yàn)閞RNA這個(gè)在RNA中最豐富的成員卻能夠提供非常少的關(guān)于轉(zhuǎn)錄本的信息，而被視為浪費(fèi)測(cè)序資源，另一方面去除rRNA可以提高低豐度轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度，使豐度的轉(zhuǎn)錄本更容易被檢測(cè)到。因此，通常在測(cè)序之前從RNA樣品中除去rRNA，rRNA去除的效率也被視為最大化讀取到轉(zhuǎn)錄物的關(guān)鍵因素。目前市面上去除rRNA的方法有使用合成的短探針結(jié)合使用RNase H去除rRNA、使用短探針結(jié)合使用磁珠吊取rRNA并去除。使用短探針進(jìn)行rRNA去除需要設(shè)計(jì)大量探針序列，對(duì)于市面上沒有的物種，投入過高。

如果從RNA樣品中去除rRNA還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種制備單鏈長探針的方法、去除核糖體RNA的方法和試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的制備單鏈長探針的方法所制備的單鏈長探針，可以用于核糖體RNA(rRNA)的雜交，然后利用酶切消化處理掉該核糖體RNA，并進(jìn)一步進(jìn)行酶切消化去除掉單鏈長探針，從而可以有效去除RNA樣本中的rRNA，去除方法簡單，成本低，而且rRNA的殘留率很低。

具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種制備單鏈長探針的方法，包括：通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本包含核糖體RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；基于所述cDNA樣本，利用引物對(duì)所述cDNA樣本進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物能夠特異性靶向所述核糖體RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括互補(bǔ)的兩條鏈；去除所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條鏈，以便獲得所述單鏈長探針；其中，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物5’端攜帶有磷酸化修飾，所述第二引物上含有至少一個(gè)硫代修飾。

本發(fā)明提供了一種制備單鏈長探針的方法，該方法借助于設(shè)計(jì)的引物，通過進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)的兩條鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后去除擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條鏈，來獲得相應(yīng)的單鏈長探針。所用到的引物包括第一引物和第二引物，其中第一引物的5’端攜帶有磷酸化修飾，能夠方便由第一引物延伸的一條鏈后續(xù)被去除。第二引物上帶有硫代修飾，能夠阻止由第二引物延伸處理的一條鏈被去除。由此，經(jīng)過硫代修飾的第二引物在PCR擴(kuò)增后，可以阻止被核酸酶降解，使得經(jīng)過第二引物延伸的一條鏈被保留下來，從而獲得單鏈長探針。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，以上所述的制備單鏈長探針的方法可以進(jìn)一步包括如下技術(shù)特征：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述引物能夠特異性靶向所述核糖體RNA保守區(qū)域的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述核糖體RNA來自于至少一個(gè)物種。例如能夠靶向多個(gè)物種，包括雞、蛙、人、小鼠、魚、家蠶、蝗蟲、魚、果蠅等等。