[發明專利]一種同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR方法及其引物和試劑盒

在審

• 申請號: 202010000522.7
• 申請日: 2020-01-02
• 公開（公告）號: CN110951923A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 王曉燕;黃應昆;李婕;單紅麗;張榮躍;倉曉燕;尹炯;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/94
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 康珉

1.一種同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR特異性引物組，四種甘蔗種傳性病毒為引起甘蔗斐濟病的斐濟病病毒、引起甘蔗花葉病的甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒，其特征在于，所述多重PCR特異性引物組由用于檢測斐濟病病毒、甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒的特異性引物組成，所述檢測斐濟病病毒的特異性引物由FDV-F和FDV-R引物組成，目標片段長度為346bp，FDV-F引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，FDV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述檢測甘蔗線條花葉病毒的特異性引物由SCSMV-F和SCSMV-R引物組成，目標片段長度為711bp，SCSMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，SCSMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述檢測高粱花葉病毒的特異性引物由SrMV-F和SrMV-R引物組成，目標片段長度為545bp，SrMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，SrMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述檢測甘蔗花葉病毒的特異性引物由SCMV-F和SCMV-R引物組成，目標片段長度為208bp，SCMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，SCMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一種同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組，所述四種甘蔗種傳性病毒為斐濟病病毒、甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒。

3.根據權利要求2所述的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括多重PCR反應液，18μL多重PCR反應液中，滅菌ddH₂O 4.0μL，2×Easy Taq SuperMix 10.0μL，10μmol/L FDV-F 0.5μL，10μmol/L FDV-R 0.5μL，10μmol/L SCSMV-F 0.5μL，10μmol/L SCSMV-R 0.5μL，10μmol/L SrMV-F 0.5μL，10μmol/L SrMV-R 0.5μL，10μmol/L SCMV-F 0.5μL，10μmol/L SCMV-R 0.5μL。

4.一種同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR方法，其特征在于，多重PCR反應體系中以樣品cDNA為模板，所用的引物為權利要求1所述的多重PCR特異性引物組，檢測結果判定方式如下：

當檢測樣品擴增到346bp大小的單一條帶時，該樣品為斐濟病病毒陽性；若無346bp條帶，則為甘蔗斐濟病病毒陰性；

當檢測樣品擴增到711bp大小的單一條帶時，該樣品為甘蔗線條花葉病毒陽性；若無711bp條帶，則為甘蔗線條花葉病毒陰性；

當檢測樣品擴增到545bp大小的單一條帶時，該樣品為高粱花葉病毒陽性；若無545bp條帶，則為高粱花葉病毒陰性；

當檢測樣品擴增到208bp大小的單一條帶時，該樣品為甘蔗花葉病毒陽性；若無208bp條帶，則為甘蔗花葉病毒陰性；

當檢測樣品同時擴增到上述四條條帶、或同時擴增到上述任意三條條帶、或同時擴增到上述任意兩條條帶，則該樣品感染了對應的病毒。

5.根據權利要求4所述的同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR方法，其特征在于，所述多重PCR反應體系為：20μL反應體系中，滅菌ddH₂O 4.0μL，2×Easy Taq SuperMix10.0μL，10μmol/L FDV-F 0.5μL，10μmol/L FDV-R 0.5μL，10μmol/L SCSMV-F 0.5μL，10μmol/L SCSMV-R 0.5μL，10μmol/L SrMV-F 0.5μL，10μmol/L SrMV-R 0.5μL，10μmol/LSCMV-F 0.5μL，10μmol/L SCMV-R 0.5μL，樣品cDNA模板2μL。

6.根據權利要求5所述的同時檢測四種甘蔗種傳性病毒的多重PCR方法，其特征在于，多重PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸10min。