[發明專利]細胞和生物分子上的直接寡核苷酸合成

在審

• 申請號: 201980091982.0
• 申請日: 2019-12-10
• 公開（公告）號: CN113423841A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 澤維爾·戈德倫;阿德里安·霍根;西爾萬·加里埃爾;杰弗里·杰德羅;羅伯特·尼科爾;托馬斯·伊貝爾特
• 申請（專利權）人: DNA斯克瑞普特公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;B01J19/00;C12N15/10
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李敏春;鄭霞

1.一種在存活細胞上合成具有預定序列的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供具有游離3’-羥基的起始子，所述起始子被附接至所述細胞的細胞表面分子或被錨定在所述細胞的細胞表面膜中；

b)在生物條件下重復以下步驟的多于一個循環：(i)使具有游離3’-O-羥基的所述起始子或延長的片段與3’-O-封閉的核苷三磷酸和不依賴模板的DNA聚合酶接觸，使得所述起始子或延長的片段通過摻入3’-O-封閉的核苷三磷酸延長以形成3’-O-封閉的延長的片段，和(ii)使所述延長的片段去封閉以形成具有游離3’-羥基的延長的片段，從而合成預定序列的寡核苷酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封閉的核苷三磷酸是3’-磷酸核苷三磷酸，并且所述去封閉步驟通過用3’-磷酸酶活性處理所述3’-O-封閉的延長的片段來進行。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述3’-磷酸酶活性由T4多核苷酸激酶、重組蝦堿性磷酸酶或牛小腸堿性磷酸酶提供。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述3’-O-封閉的核苷三磷酸是3’-酯封閉的核苷三磷酸，并且所述去封閉步驟通過用酯酶活性處理所述3’-O-酯封閉的延長的片段來進行。

5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述生物條件包括pH在6.8至7.8的范圍內的緩沖生理鹽和在15℃至41℃的范圍內的溫度。

6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述存活細胞是哺乳動物細胞。

7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述起始子包括具有共價附接至5’末端的親脂性錨的寡核苷酸，其中所述親脂性錨穩定地插入所述存活細胞的細胞表面膜中。

8.一種生成具有細胞特異性寡核苷酸條形碼的cDNA文庫的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)在生物條件下，在細胞群中每個細胞的細胞表面膜上合成獨特的寡核苷酸條形碼，以形成條形碼編碼的細胞的群體；

(b)將每個條形碼編碼的細胞分離到反應器中；

(c)裂解每個反應器中的條形碼編碼的細胞；

(4)在每個反應器中進行逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，以產生具有細胞特異性寡核苷酸條形碼的cDNA文庫。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述合成步驟包括(a)將起始子附接至所述群體的每個所述細胞的所述細胞表面膜上，和(b)重復以下循環：(i)在生物條件下，使具有游離3’-O-羥基的所述起始子或延長的片段與3’-O-封閉的核苷三磷酸和不依賴模板的DNA聚合酶接觸，使得所述起始子或延長的片段通過摻入3’-O-封閉的核苷三磷酸延長以形成3’-O-封閉的延長的片段，和(ii)使所述延長的片段去封閉以形成具有游離3’-羥基的延長的片段。

10.根據權利要求9所述的方法，其中每個所述循環還包括在將所述細胞的所述群體拆分到單獨的反應混合物中，在所述單獨的反應混合物中，所述起始子或延長的片段被不同種類的核苷三磷酸延長以形成所述延長的片段，之后將單獨的反應混合物的所述細胞組合。

11.根據權利要求8至10中任一項所述的方法，其中所述反應器是油包水乳液的膠束。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述膠束由微流體裝置產生。

13.根據權利要求9至12中任一項所述的方法，其中來自所述反應器的所述cDNA被組合并通過高通量DNA測序進行分析。