[發明專利]二羧酸合成相關酶及使用其生產二羧酸的方法

在審

• 申請號: 201980091206.0
• 申請日: 2019-12-04
• 公開（公告）號: CN113383073A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 金京憲;蒂魯馬萊薩米·巴布;金度亨
• 申請（專利權）人: 高麗大學校產學協力團
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/04;C12N9/20;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/44;C12P7/64;C12R1/74
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 鄭元博

本發明涉及二羧酸合成相關酶、編碼該酶的基因以及使用該酶生產二羧酸的方法。本發明的基因或由該基因編碼的酶代替現有的二羧酸化學生產，可用于生物酶法生產二羧酸，因此預期具有高的工業實用性。

技術領域

本發明涉及一種參與二羧酸(DCA)生產的酶、編碼該酶的基因、包含該基因的載體以及使用該酶生產二羧酸的方法。

背景技術

二羧酸(Dicarboxylic acid，DCA)是含有兩個羧基基團(-COOH)的有機化合物。二羧酸的分子通式可以用HO₂C-R-CO₂H來表示，其中R可以是脂肪族或芳香族基團。通常，二羧酸表現出類似于單羧酸的化學反應和反應性。二羧酸也用于制備共聚物，例如聚酰胺和聚酯。工業中使用最廣泛的二羧酸是己二酸，它是用于生產尼龍的前體。二羧酸的其他例子包括天冬氨酸和谷氨酸，它們是人體中的兩種氨基酸。此外，其他羧酸已用于各種工業領域。

此類二羧酸已通過化學工藝或生物方法制備。作為關于制備二羧酸的一個例子，作為二羧酸中的一種的癸二酸，即使使用苯酚和甲酚也可以合成它，但已知蓖麻油氧化是最環保且價格最具競爭力的方法。蓖麻油通過蒸汽裂解進行酯交換，并通過酯交換生產蓖麻油酸。將如此產生的蓖麻油酸在250℃下加熱后與堿(例如熔融苛性鈉等)混合，經苛性堿消化分解為辛醇(2-辛醇)和癸二酸。將如此產生的產物純化以得到高純度癸二酸(美國專利第5,952,517和6,392,074號)。然而，這種方法的缺點是需要在300℃或更高的高溫處理下才能達到上述目的，并且使用諸如硫酸的強酸，以及由于使用了諸如重金屬、有毒有機溶劑等物質而產生大量的環境污染物。除了使用化學方法制備癸二酸外，還可以通過電解己二酸單乙酯鉀(Potassium monoethyl adipate)來進行這種生產。

在之前的研究中，已經報道了使用ω-氧化能力優異且β-氧化被阻斷的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)菌株通過生物方式來生產二羧酸。然而，沒有關于具體二羧酸生物合成途徑的報道。因此，確定二羧酸生物合成途徑以開發能夠大量生產二羧酸的有用菌株是重要的。

因此，本發明人已經發現通過使用產生二羧酸的熱帶假絲酵母菌株的進化方法來篩選與二羧酸生物合成相關的基因，并且使用這些基因來確定生物合成途徑。因此，基于這些事實完成了本發明。

[相關技術文件]

[專利文件]

韓國專利申請第10-2015-0149253號

[非專利文件]

David L.Craft等人，《應用與環境微生物學》，69(10)：5983-5991，2003

發明內容

技術問題

因此，本發明的一個目的是提供一種參與二羧酸(DCA)生物合成的蛋白質，該蛋白質包括選自以下中的一個或多個：脂肪酶(LIP1)、細胞色素P450 52B1(CYP52B1)、NADPH-細胞色素P450還原酶(NCP1)、長鏈醇氧化酶(FAO1)和醛脫氫酶(ALD1)。

本發明的另一個目的是提供包含編碼該蛋白質的基因的重組載體，以及包含該重組載體的用于生產二羧酸的組合物。

本發明的又一個目的是提供一種用于生產二羧酸的方法，該方法包括培養用包含該基因的載體轉化的微生物。

技術方案

在以前的研究中，二羧酸的生產是通過化學方法進行的，并且大多數已知生產二羧酸的菌株都由于易受到底物的細胞毒性的影響而死亡。因此，通過生物方法生產二羧酸或確定二羧酸生產途徑并不容易。于是，本發明人使用先前研究中的進化方法制造了對細胞毒性底物具有高耐受性并且產生二羧酸的菌株，并從該菌株中篩選了與二羧酸生物合成相關的酶和編碼該酶的基因。因此，基于這些事實完成了本發明。