[發明專利]減少非經典支鏈氨基酸錯摻的方法

在審

• 申請號: 201980084812.X
• 申請日: 2019-12-10
• 公開（公告）號: CN113557305A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: P·豪普特曼;A·科爾科萊斯·加西亞;C·T·拉特曼;A·馬特森;P·諾伊鮑爾
• 申請（專利權）人: 賽諾菲-安萬特德國有限公司;柏林工業大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N9/04;C12N9/10;C12N9/88
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種用于在微生物宿主細胞中產生目標重組多肽的方法，其包括以下步驟：

(d)向微生物宿主細胞中引入編碼所述目標多肽的多核苷酸，所述微生物宿主細胞已經被修飾，使得所述微生物宿主細胞中的選自酮醇酸還原異構酶(NADP(+))活性(EC1.1.1.86)、乙酰羥酸合酶活性(EC 2.2.1.6)、天冬氨酸激酶活性(EC 2.7.2.4)、高絲氨酸脫氫酶活性(EC 1.1.1.3)和L-蘇氨酸脫水酶(EC 4.3.1.19)的酶活性與未經修飾的微生物宿主細胞中的所述酶活性相比被調節；以及

(e)在所述微生物宿主細胞中表達所述目標多肽。

2.根據權利要求1所述的方法，其中與已經通過在未經修飾的微生物宿主細胞中表達而產生的多肽相比，所產生的目標多肽顯示出更低的非經典支鏈氨基酸錯摻。

3.根據權利要求1和2中任一項所述的方法，其中所述方法還包括從所述細胞中分離所述多肽，以及純化所述多肽。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述純化包括富集不包含非經典支鏈氨基酸的多肽。

5.根據權利要求1和4所述的方法，其中所述酶活性通過在所述微生物宿主細胞中引入和表達編碼具有所述酶活性的多肽的多核苷酸來增加。

6.根據權利要求5中任一項所述的方法，其中所述微生物宿主細胞不表達具有所述酶活性的內源多肽。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述目標多肽是治療性肽或多肽。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中編碼所述目標多肽的多核苷酸和/或編碼具有所述酶活性的多肽的多核苷酸與誘導型啟動子可操作地連接。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述微生物宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。

10.一種用于減少至少一種非經典支鏈氨基酸向微生物宿主細胞中表達的目標重組多肽中的錯摻的方法，所述方法包括：

(a)調節所述微生物宿主細胞中的選自以下的酶活性：酮醇酸還原異構酶(NADP(+))活性(EC 1.1.1.86)、乙酰羥酸合酶活性(EC 2.2.1.6)、天冬氨酸激酶活性(EC 2.7.2.4)、高絲氨酸脫氫酶活性(EC 1.1.1.3)和L-蘇氨酸脫水酶(EC 4.3.1.19)；

(b)向所述微生物宿主細胞中引入編碼所述目標多肽的多核苷酸；以及

(c)在所述微生物宿主細胞中表達所述目標多肽。

11.根據權利要求10所述的方法，其中至少一種非經典支鏈氨基酸選自正纈氨酸、正亮氨酸和β-甲基正亮氨酸。

12.具有選自酮醇酸還原異構酶(NADP(+))活性(EC 1.1.1.86)、乙酰羥酸合酶活性(EC2.2.1.6)、天冬氨酸激酶活性(EC 2.7.2.4)、高絲氨酸脫氫酶活性(EC 1.1.1.3)和L-蘇氨酸脫水酶(EC 4.3.1.19)的酶活性的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸用于減少至少一種非經典支鏈氨基酸向微生物宿主細胞中產生的目標重組多肽中的錯摻的用途。

13.微生物宿主細胞用于產生目標重組多肽的用途，其中所述微生物宿主細胞已經被修飾，使得所述微生物宿主細胞中的選自酮醇酸還原異構酶(NADP(+))活性(EC1.1.1.86)、乙酰羥酸合酶活性(EC 2.2.1.6)、天冬氨酸激酶活性(EC 2.7.2.4)、高絲氨酸脫氫酶活性(EC 1.1.1.3)和L-蘇氨酸脫水酶(EC 4.3.1.19)的酶活性與未經修飾的微生物宿主細胞中的所述酶活性相比被調節。