[發明專利]固相螯合劑材料，其制備方法及其用于純化蛋白質的用途

在審

• 申請號: 201980078337.5
• 申請日: 2019-11-22
• 公開（公告）號: CN113164915A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: R·法比斯
• 申請（專利權）人: 庫貝生物科技有限公司
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22;B01J20/288;B01J20/30;B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 李穎;林柏楠

本發明涉及一種固相螯合劑材料，可用于蛋白質純化等方面。該固相螯合劑材料包括一個固相、結合至所述固相的多胺基團和結合至所述多胺基團的螯合基團。對于每個多胺基團，至少一部分的多胺基團與至少兩個螯合基團連接。每個螯合基團包含一個或多個氨基聚羧酸基團(APA基團)，條件是每個與至少兩個螯合基團連接的多胺基團的APA基團的數目為至少三個。幾個APA可以形成線性螯合鏈或支化螯合鏈，其中APA基團通過雙功能或三功能連接子相互連接。本發明的負載金屬離子固相螯合劑材料展示強大的金屬結合能力、對螯合劑、還原劑和堿性溶液的高穩定性、對蛋白質的高親和力，以及極高的結合能力。此外，本發明涉及一種制備所述固相螯合劑材料的方法和一種以負載金屬離子的固相螯合劑材料純化組氨酸標記重組多肽和蛋白質、磷蛋白和金屬配位蛋白質的方法。

技術領域

本發明涉及固相螯合劑材料的領域和這種固相螯合劑材料的制備方法。此外，本發明涉及一種用負載金屬的固相螯合劑材料以純化多肽和蛋白質的方法，以及負載金屬的固相螯合劑材料包括用于固定化蛋白質的金屬親和純化的用途。

技術背景

由Porath(《自然》258：598，1975)開發的固定化金屬親和色譜法(IMAC)已成為用作純化重組蛋白的標準方法；當需要對大量重組蛋白進行純化時，它仍是最受歡迎的方法之一。

該方法的原理是基于在蛋白質的氨基酸側鏈上引入多個組氨酸基團，這使它們對固定的金屬離子具有更高的親和力。這些所謂的“組氨酸標記”由連續的組氨酸殘基以及組氨酸與其他氨基酸結合而成，通常包括六至十個組氨酸。這些“組氨酸標記”顯示出比天然蛋白質高得多的對固定化金屬離子的親和力，因此可以進行高度純化，尤其是在將低濃度的咪唑添加到結合和洗滌緩沖液中時，可減少沒有組氨酸標記的蛋白質的非特異性相互作用。

或者，IMAC可用于純化磷蛋白，其中金屬離子直接與磷酸基團結合。通過這種方法，可以將磷蛋白與不具有磷酸基團的蛋白分離；不具有磷酸基團的蛋白與金屬離子之間沒有結合或只有近似弱的結合。

IMAC樹脂可與金屬(例如Zn和Cu)結合使用，以可逆方式結合金屬結合蛋白(例如鋅指蛋白)和銅相互作用蛋白(例如銅氧還蛋白或血藍蛋白)。

用于IMAC的配位體可以基于配位體可以在金屬離子上占據的配位體位置數進行分類。因此，獲得三個金屬離子結合基團(例如胺、羧基、磷酸鹽等)的螯合劑被稱為三配位基螯合劑。四配位基螯合劑可以在金屬離子上配位到四個位置，而五配位基螯合劑可以占據五個位置。

二十多年來，作為三配位基螯合劑的固相固定化亞氨基二乙酸(IDA)和作為四配位基螯合劑的氨基三乙酸(NTA)被確立為IMAC的標準材料。四配位基“Talon”配位體以及五配位基螯合劑，例如三羧甲基乙二胺(TED)，是也可以從市場上買得到的替代螯合劑。近年來，一些基于五配位基螯合劑的樹脂，例如完整的His Tag樹脂(羅氏診斷有限責任公司)和Ni Sepharose Excel(通用電氣醫療)已進入市場。

對于IMAC，已經成功地應用了許多不同金屬，因此已研究了例如Ni、Co、Cu、Fe、Ca、Zn、Al、Eu、Ga和Sc。為了純化磷蛋白，廣泛使用了AI與IDA結合使用，以及與Fe、Ga和Eu與NTA結合使用。

應當指出的是，特別是可以非常容易獲得且成本低的亞氨基二乙酸具有以下缺點：僅通過三個功能化就能將金屬離子固定在固相上；因此眾所周知，金屬離子被浸出到緩沖液中，蛋白質結合能力從而降低，且該洗脫緩沖液中可能含有痕量的金屬離子。并且，在金屬離子上該蛋白質具有幾乎三個自由配位位點，一些沒有組氨酸標記的蛋白質也與樹脂結合，因此純化后獲得了污染的洗脫液。