[發明專利]利用源自干酪乳桿菌的兩種啟動子共表達兩種靶蛋白的表面表達載體以及使用其在微生物表面上表達蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201980076721.1
• 申請日: 2019-10-10
• 公開（公告）號: CN113330120A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 樸永鐵;奇大殷;南坰駿;邊世恩;文哈娜;姜顯俊;咸京洙
• 申請（專利權）人: 生物領先公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/52
• 代理公司: 北京鴻元知識產權代理有限公司 11327
• 代理人: 李靜;黃麗娟

1.一種用于表達靶蛋白的表面表達載體，該表面表達載體包括：第一啟動子、編碼用于表面錨定的聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因、和編碼靶蛋白的基因；以及第二啟動子、編碼用于表面錨定的聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因、和編碼靶蛋白的基因。

2.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述第一啟動子由SEQ ID NO：1表示。

3.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述第二啟動子由SEQ ID NO：2表示。

4.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因源自芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株。

5.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，在所述編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因的末端插入接頭，并且所述編碼靶蛋白的基因插入已插入的接頭中。

6.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述靶蛋白是其中該靶蛋白的一部分氨基酸序列已經被移除或者以定點方式突變以便有利于表面表達的一種蛋白質。

7.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述第一啟動子是源自乳酸菌的醛縮酶啟動子(Pald)。

8.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述第二啟動子是源自乳酸菌的半乳糖變旋酶啟動子(Pgm)。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的表面表達載體，其中，所述載體應用于革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。

10.一種用權利要求1至8中任一項所述的表面表達載體轉化的微生物。

11.根據權利要求10所述的微生物，其中，用于轉化的微生物是經修飾使其不產生參與所表達的靶蛋白降解的胞內或胞外蛋白酶，以便有利于所述靶蛋白的細胞表面表達的微生物。

12.根據權利要求10所述的微生物，其中，該微生物是乳酸菌。

13.根據權利要求1所述的表面表達載體，其中，所述編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因是pgsA并具有SEQ ID NOs：21至24和32至34中的任意一種核苷酸序列。

14.根據權利要求13所述的表面表達載體，其中，所述基因pgsA源自產生聚-γ-谷氨酸的芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株。

15.根據權利要求13所述的表面表達載體，其中，所述編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因pgsA具有SEQ ID NO：25的核苷酸序列。

16.根據權利要求13所述的表面表達載體，其中，在所述基因pgsA的末端插入接頭，并且所述編碼靶蛋白的基因插入已插入的接頭中。

17.根據權利要求13所述的表面表達載體，其中，所述靶蛋白是其中該靶蛋白的一部分氨基酸序列已經被移除或者以定點方式突變以便有利于表面表達的一種蛋白質。

18.根據權利要求13至17中任一項所述的表面表達載體，其中，該載體應用于革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。

19.一種使用權利要求13至17中任一項所述的表面表達載體轉化的微生物。

20.根據權利要求19所述的微生物，其中，用于轉化的微生物是經修飾使其不產生參與所表達的靶蛋白降解的胞內或胞外蛋白酶，以便有利于所述靶蛋白的細胞表面表達的微生物。