[發明專利]蛋白質的分泌生產方法

在審

• 申請號: 201980069863.5
• 申請日: 2019-10-25
• 公開（公告）號: CN112930359A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 松田吉彥
• 申請（專利權）人: 味之素株式會社
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12P21/02;C12N15/62;C12N15/77
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張濤

1.一種異源蛋白質的制造方法，其包含：

培養具有用于分泌表達異源蛋白質的基因構建體的棒狀細菌；和

回收通過分泌生產而產生的異源蛋白質，

所述方法中，對所述棒狀細菌進行了修飾，以使其與未修飾菌株相比，LepB蛋白質的活性升高，

所述基因構建體在5’至3’的方向上包含：在棒狀細菌中發揮功能的啟動子序列、編碼TorA信號肽的核酸序列和編碼異源蛋白質的核酸序列，

所述異源蛋白質作為與所述TorA信號肽的融合蛋白進行表達。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，

所述LepB蛋白質是下述(a)、(b)或(c)所述的蛋白質：

(a)包含序列編號2表示的氨基酸序列的蛋白質；

(b)包含下述氨基酸序列并且具有針對TorA信號肽的信號肽酶活性的蛋白質，所述氨基酸序列是在序列編號2表示的氨基酸序列中包含1～10個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列；

(c)包含相對于序列編號2表示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列并且具有針對TorA信號肽的信號肽酶活性的蛋白質。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，

通過提高lepB基因的表達，而提高了所述LepB蛋白質的活性。

4.根據權利要求3所述的方法，其中，

所述lepB基因的表達，通過提高該基因的拷貝數和/或修飾該基因的表達調節序列而得到了提高。

5.根據權利要求1～4中任一項所述的方法，其中，

所述TorA信號肽是下述(a)、(b)或(c)所述的肽：

(a)包含序列編號46表示的氨基酸序列的肽；

(b)包含下述氨基酸序列并且具有作為Tat系統依賴性信號肽的功能的肽，所述氨基酸序列是在序列編號46表示的氨基酸序列中包含1～3個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列；

(c)包含相對于序列編號46表示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列并且具有作為Tat系統依賴性信號肽的功能的肽。

6.根據權利要求1～5中任一項所述的方法，其中，

所述TorA信號肽包含序列編號46表示的氨基酸序列。

7.根據權利要求1～6中任一項所述的方法，其中，

所述通過分泌生產而產生的異源蛋白質是完全除去了所述TorA信號肽的異源蛋白質。

8.根據權利要求1～7中任一項所述的方法，其中，

對所述棒狀細菌進一步進行了修飾，以使其保持編碼變異型PhoS蛋白質的phoS基因。

9.根據權利要求8所述的方法，其中，

所述變異是野生型PhoS蛋白質中與序列編號29的302位的色氨酸殘基相對應的氨基酸殘基被芳香族氨基酸和組氨酸以外的氨基酸殘基取代的變異。

10.根據權利要求9所述的方法，其中，

所述芳香族氨基酸和組氨酸以外的氨基酸殘基是賴氨酸殘基、丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、絲氨酸殘基、半胱氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、天冬氨酸殘基或天冬酰胺殘基。

11.根據權利要求9或10所述的方法，其中，

所述野生型PhoS蛋白質是下述(a)、(b)或(c)所述的蛋白質：

(a)包含序列編號29～34中任一項表示的氨基酸序列的蛋白質；

(b)包含下述氨基酸序列并且具有作為PhoRS系統的傳感器激酶的功能的蛋白質，所述氨基酸序列是在序列編號29～34中任一項表示的氨基酸序列中包含1～10個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列；

(c)包含相對于序列編號29～34中任一項表示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列并且具有作為PhoRS系統的傳感器激酶的功能的蛋白質。