[發(fā)明專利]高通量高效細胞轉(zhuǎn)染的方法及裝置

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980068022.2
• 申請日: 2019-08-30
• 公開（公告）號: CN113166706A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 維沙爾·坦登;查爾斯·A·利桑德羅;詹娜·L·巴列斯特里尼;喬納森·R·科佩塔;帕特里夏·A·斯維爾克
• 申請（專利權(quán)）人: 查爾斯·斯塔克·德雷珀實驗室有限公司
• 主分類號: C12M3/06
• 分類號: C12M3/06;C12M1/42
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 馬叢

遺傳物質(zhì)和其他材料向細胞的轉(zhuǎn)移是在無需人工干預(yù)、自動化、高通量、連續(xù)的過程中進行的。使用微流體動力學(xué)鞘流結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)包括將細胞從含有細胞培養(yǎng)基的側(cè)流輸送至包含電穿孔緩沖液的中央流的裝置。電穿孔可以在組件中進行，在該組件中，兩個或多個微流體通道以平行結(jié)構(gòu)配置提供，并且在該組件中，各種層可以堆疊在一起以形成層壓型結(jié)構(gòu)。

優(yōu)先權(quán)聲明

本申請根據(jù)美國專利法第35編第119條(e)的規(guī)定，要求2018年8月31日提交的序列號為62/725,382的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，并通過引用將其全部內(nèi)容合并與此。

背景技術(shù)

生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物研究和其他領(lǐng)域的許多應(yīng)用都涉及將遺傳物質(zhì)引入細胞的技術(shù)。當應(yīng)用細菌或非動物真核細胞(包括植物細胞)時，經(jīng)常使用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”。“轉(zhuǎn)染”幾乎總是指真核細胞的研究，而“轉(zhuǎn)導(dǎo)”通常適用于病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到真核細胞中。

感興趣的材料不僅可以包括DNA、siRNA、mRNA、RNP復(fù)合物，還可以包括小分子或蛋白質(zhì)，例如抗體。在許多情況下，這種“貨物”材料的轉(zhuǎn)移涉及在細胞膜上打開瞬時孔隙或“洞”，以允許其吸收，從而改變或從基因上修飾細胞。

常用于暫時透化細胞的技術(shù)是電穿孔。當進行電穿孔時要考慮的參數(shù)包括細胞特性(例如細胞大小、形狀、膜結(jié)構(gòu)、表面電荷)、細胞環(huán)境以及所施加電場的屬性(例如，脈沖強度、脈沖數(shù)量、脈沖持續(xù)時間、脈沖形狀和/或頻率)。通常認為，電穿孔過程中的膜透化發(fā)生在所施加的電場誘導(dǎo)跨膜電勢的閾值或“電穿孔閾值”之后，并且在給定的施加的電場下，存在成功電穿孔所需的脈沖數(shù)量和脈沖長度的閾值。Schwan方程和相關(guān)推導(dǎo)常用于估計細胞的跨膜電位，該電位根據(jù)相關(guān)實驗參數(shù)而開發(fā)，包括外加電場、細胞大小、介質(zhì)電導(dǎo)率、細胞質(zhì)和細胞膜以及膜厚度(Analytical Description of Transmembrane VoltageInduced by Electric Fields on Spheroidal Cells，Biophysical Journal，第79卷，2000年8月，670-679頁)。

發(fā)明內(nèi)容

傳統(tǒng)上，通過電穿孔對細胞進行的基因修飾是使用比色杯進行的批量處理。不太普遍的，可能采用批量配置的一些缺少自動化功能的商業(yè)設(shè)備。

例如，現(xiàn)有的電穿孔過程通常使用專門的低電導(dǎo)率緩沖液，這可能會對細胞活力產(chǎn)生負面影響，尤其是在長時間暴露的情況下。因此，批量加工需要若干緩沖液更換和清洗步驟，這使得該方法耗費大量人力，并且難以擴大規(guī)模以滿足不斷增長的大批量生產(chǎn)需求。手動洗滌和/或過濾步驟也很慢，因此細胞仍會暴露在電穿孔緩沖液中達數(shù)分鐘至約一小時的時間。這些步驟通常與細胞流失(細胞回收率低)有關(guān)。高通量轉(zhuǎn)染系統(tǒng)同樣缺乏。

隨著細胞療法趨向于使用同種異體而非自體細胞來源進行大規(guī)模生產(chǎn)，使用批量方法對細胞療法進行生物處理變得越來越棘手。

此外，市售的電穿孔裝置會使生物制品與電極直接接觸而暴露，從而由于局部加熱和法拉第副產(chǎn)物(水合氫離子、羥基離子、氯、自由基和電極分解副產(chǎn)物(例如，鋁離子和微粒))而造成潛在損壞。沒有微流體，許多傳統(tǒng)的電穿孔方法無法將熱量從熱敏感的生物實體中轉(zhuǎn)移，或者不能有效地進行轉(zhuǎn)移。在某些情況下，細胞(或其他基質(zhì))和有效載荷(貨物)缺乏共定位，導(dǎo)致效率低下和(有價值的)材料損失。

因此，需要至少解決上述一些問題的設(shè)備和方法。

本文描述了以無需人工干預(yù)、自動化、高通量、連續(xù)的過程進行遺傳物質(zhì)或其它材料向細胞轉(zhuǎn)移的方法。

一些實施方案依賴于微流體動力學(xué)鞘流結(jié)構(gòu)，并且包括將細胞從含有諸如細胞培養(yǎng)基的側(cè)流輸送至包含電穿孔緩沖液的中央流的裝置。電穿孔可以在組件中進行，在組件中，兩個或多個微流體通道以平行結(jié)構(gòu)配置提供，并且在組件中，各層可以堆疊在一起以形成層壓型結(jié)構(gòu)。每個微流體通道都配有一對電極，電極的結(jié)構(gòu)最好能承受長期、連續(xù)和高通量的操作。