[發明專利]用于生產有機酸的微生物細胞系的分離

在審

• 申請號: 201980051169.0
• 申請日: 2019-06-17
• 公開（公告）號: CN112513246A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 保羅·布盧姆;桑巴西瓦·拉奧·齊古魯帕提;德里克·杰梅恩·懷特
• 申請（專利權）人: SP配料研發有限公司
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12P1/00;C12P1/02
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金海霞;劉慧

適合用于有機酸的工業規模生產的微生物細胞系以及制造和分離這種細胞系的方法。

優先權聲明

本發明要求于2018年6月18日提交的美國專利申請號62/686,463的優先權，其全部內容通過引用并入本文。

技術領域

本公開整體上涉及過量生產有機酸的微生物細胞系及其制造方法。

背景技術

有機酸是指具有酸性的含碳化合物。有機酸的實例包括乙酸、檸檬酸、葡糖酸、乳酸、丙酸等。由于它們是可完全降解的，有機酸可以被用在可生物降解聚合物的生產中。它們也具有其他重要的工業應用，包括作為食品添加劑。

發明內容

本公開提供了適合用于有機酸的工業規模生產的微生物細胞系以及制造和分離這種細胞系的方法。

在一個方面，提供了制造和分離微生物細胞系的方法，其中與親代微生物細胞系相比，所分離的微生物細胞系過量生產有機酸。所述方法使用了在增補有有機酸的pH受控的培養基中，優選在非固定培養中親代菌株的連續傳代，其中pH值被控制在高于所述有機酸的pKa值。在一些實施方式中，所述pH優選在約5.5和約7.5之間的范圍內，更優選為中性或接近中性，在約6.0和約7.0之間，并且最優選為約7.0。在一些實施方式中，所述培養基是固化的。在一些實施方式中，所述培養基增補有足以抑制正常微生物細胞生長的量的有機酸，例如以降低倍增速率或生長速率，例如，將倍增速率或生長速率降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。在一些實施方式中，在連續傳代的連續迭代中以逐漸增加的量增補所述有機酸。在一些實施方式中，在連續傳代的連續迭代中以相同的量增補所述有機酸。在一些實施方式中，所述有機酸是丙酸、乳酸、乙酸或丁酸。在一些實施方式中，所述有機酸是丙酸，例如，所述培養基增補有約1.0％-3.0％的丙酸，例如，約3.0％的丙酸。在一些實施方式中，所述親代細胞系是野生型生物。在一些實施方式中，所述親代細胞系是來源于單細胞微生物的微生物細胞系。

在另一方面，提供了過量生產有機酸的微生物細胞系，其中在增補有有機酸的pH受控的培養基中使用連續傳代來制造和分離所述微生物細胞系，其中pH值被控制在高于所述有機酸的pKa值，優選在約5.5和約7.5之間的范圍內，更優選為中性或接近中性，在約6.0和約7.0之間，并且最優選為約7.0。

在另一方面，提供了過量生產有機酸的微生物細胞系，其中所述微生物細胞系具有直接或間接地主要改變細胞包膜的結構、組成和/或功能的突變。優選地，所述微生物細胞系包含表3中鑒定的至少2種基因組突變或類似突變。更優選地，所述微生物細胞系包含表3中鑒定的所有基因組突變或同源突變。在一個實施方式中，所述微生物細胞系在表3中鑒定的至少2個基因中包含突變或與其類似的突變。在另一個實施方式中，所述微生物細胞系在表3中鑒定的所有基因或其同源物(例如，在本文所述的另一菌種中的同源基因)中包含突變。在另一個實施方式中，所述微生物細胞系在含O抗原連接酶結構域蛋白中包含突變。在另一個實施方式中，所述微生物細胞系在M18家族氨肽酶中包含突變。在另一個實施方式中，所述微生物細胞系在氨基酸通透酶中包含突變。在另一個實施方式中，所述微生物細胞系在腺嘌呤糖基化酶中包含突變。

所述微生物可以是任何生產有機酸的微生物。在一個實施方式中，所述微生物來自丙酸桿菌屬(Propionibacterium)(Acidipropionibacterium)，并且更優選為產丙酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)菌種。在另一個實施方式中，所述微生物來自乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，并且更優選為嗜酸性乳酸桿菌(L.acidophilus)菌種。在另一個實施方式中，所述微生物來自醋桿菌屬(Acetobacter)。在另一個實施方式中，所述微生物來自葡糖桿菌屬(Gluconobacter)。在另一個實施方式中，所述微生物來自梭菌屬(Clostridium)，并且更優選為丁酸梭菌(C.butyricum)菌種。在一些實施方式中，所述有機酸是丙酸。在一些實施方式中，所述有機酸是乳酸。在一些實施方式中，所述有機酸是乙酸。在一些實施方式中，所述有機酸是丁酸。