[發(fā)明專利]用于準確且經(jīng)濟高效的測序、單體型分型和組裝的基于單管珠粒的DNA共條形碼化在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201980046212.4 | 申請日: | 2019-05-07 |
| 公開(公告)號: | CN112639094A | 公開(公告)日: | 2021-04-09 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 拉多吉·T·德爾馬納茨;布羅克·A·彼得斯;王歐 | 申請(專利權(quán))人: | 深圳華大智造科技股份有限公司;深圳華大生命科學研究院 |
| 主分類號: | C12N15/10 | 分類號: | C12N15/10;C12N15/66;C12N9/00;C40B20/04;C40B70/00 |
| 代理公司: | 上海勝康律師事務(wù)所 31263 | 代理人: | 樊英如;張華 |
| 地址: | 518083 廣東省深圳*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 用于 準確 經(jīng)濟 高效 體型 組裝 基于 單管珠粒 dna 條形碼 | ||
1.一種無需使用納米滴(nanodrops)而能制備用于靶核酸測序的測序文庫的方法,該方法包括:
(a)將插入序列轉(zhuǎn)座到所述靶核酸的第一片段中,其中所述插入序列包含雜交序列,并且其中所述轉(zhuǎn)座在所述第一片段中產(chǎn)生切口;
(b)將(i)來自(a)的所述靶核酸的所述第一片段、(ii)夾板寡核苷酸和(iii)珠粒群體合并成單個混合物,其中每個珠粒包含固定在其上的捕獲寡核苷酸,所述捕獲寡核苷酸包括
1)包含標簽(或條形碼)的序列,其中每個包含標簽(或條形碼)的序列包含條形碼序列,所述條形碼序列可選地是三重條形碼序列,其中固定在相同單個珠粒上的所述寡核苷酸包含相同的包含標簽(或條形碼)的序列,而大多數(shù)珠粒具有不同的包含標簽(或條形碼)的序列,
2)與夾板寡核苷酸的至少一部分互補的共同序列,其中所述夾板寡核苷酸的另一部分與所述雜交序列的至少一部分互補;
3)可選地,第一PCR引物退火位點;
(c)將單個珠粒的捕獲寡核苷酸連接到單個第一片段的插入的雜交序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述捕獲寡核苷酸包含所述第一PCR引物退火位點,還包括使3'分支連接銜接子寡核苷酸在所述切口處連接至所述第一片段,其中銜接子寡核苷酸的連接是3'分支連接,以及其中所述銜接子寡核苷酸包含第二PCR引物退火位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中所述3'分支連接銜接子寡核苷酸是平末端銜接子,并且所述3'分支連接包括將來自所述平末端銜接子的5'磷酸在所述第一片段的所述切口處共價連接至凹陷的3'羥基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的方法,其中所述第一PCR引物退火位點和所述第二PCR引物退火位點具有不同的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法,其中所述3’分支連接銜接子寡核苷酸包含條形碼序列,其任選地是樣本條形碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法,其中在將所述插入序列轉(zhuǎn)座到所述第一片段中的步驟中,所述轉(zhuǎn)座酶保持與所述第一片段結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法,包括從所述第一片段中去除所述轉(zhuǎn)座酶,從而產(chǎn)生亞片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,包括擴增所述亞片段以產(chǎn)生擴增子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,包括對所述擴增子測序以產(chǎn)生序列讀段,其中具有相同條形碼序列的序列讀段來自相同的第一片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法,其中所述靶核酸是基因組DNA,任選地是人基因組DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中將兩個不同的轉(zhuǎn)座子插入所述第一片段。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法,其中所述靶核酸是基因組DNA,任選地來自真核生物,任選地來自哺乳動物。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法,其中所述基因組DNA來自單個個體生物,例如單個人類受試者。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的方法,其中所述靶核酸來自原核生物或原核生物的異質(zhì)群體,例如來自個體的微生物組。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法,其中在步驟(a)之前不擴增所述靶核酸。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法,其中所述珠粒包含至少100000個拷貝的所述捕獲寡核苷酸,或包含至少400000個拷貝的所述捕獲寡核苷酸。
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