[發明專利]色譜珠、其生產及用途

在審

• 申請號: 201980043553.6
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN112292203A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: J·F·奧曼;J·U·漢松;J·法羅克;E·霍姆格倫;D·B·L·揚松
• 申請（專利權）人: 思拓凡生物工藝研發有限公司
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/281;B01J20/291;B01J20/286;C08B37/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;彭昶

本發明涉及色譜珠、其生產和用途。更接近地，本發明涉及小的、剛性的和不可滲透的瓊脂糖珠，其適合于例如在高效液相色譜(HPLC)中作為固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白質；和生產所述珠的方法。

技術領域

本發明涉及色譜珠、其生產和用途。更接近地，本發明涉及小的、剛性的和不可滲透的瓊脂糖珠，其主要適合于例如在高效液相色譜(HPLC)中作為固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白質；和生產所述珠的方法。

背景技術

HPLC(高效液相色譜)是一種液相色譜方法，其對于化學和生化化合物的研究、制造和診斷至關重要。通常由于獲得的速度和分辨率，常常在高壓色譜系統中對生物分子(例如肽、蛋白質及其潛在的變體)進行表征和分析。兩種類型的柱主要用于常規分析。它們是填充柱或整體柱。填充柱包含最常呈球形珠形狀的顆粒固定相，所述球形珠彼此緊密堆積，且柱床高度范圍為3-30 cm。由于其剛性，用于HPLC柱的市售固定相通常基于二氧化硅或合成有機樹脂例如聚苯乙烯。在較短的柱中使用較小直徑的珠是一種非常有效的方式，以便以快速率實現高效能分離，但同時也意味著相當高的背壓。因此，僅使用非常剛性的固定相材料。最常用的技術是反相色譜。

填充柱目前可用的HPLC固定相是基于1.7-10μm的珠狀二氧化硅或合成聚合物，其中小直徑的珠使得色譜效率提高。

分析性蛋白質分離的主要挑戰是獲得具有高分辨率和低非特異性吸附的快速分離。填充柱中的珠是多孔的或無孔的，具有各自的優點和缺點。二氧化硅和合成的無孔顆粒具有擴散路徑短，僅在珠表面上結合的優勢，這意味著更快的質量轉移。多孔珠提供更大的表面積，這意味著更多的與分析物相互作用的位點和更高的結合能力。

已經描述了用于HPLC的其它類型的固定相。在US 5135650中，Hjertén等人描述了通過收縮珠或填充孔將多孔瓊脂糖珠轉化成基本上不滲透蛋白質的珠的方法。通過用不同的有機溶劑(例如二噁烷和氯仿)進行順序處理并結合交聯，進行Hjertén方法的收縮。填充是通過添加可聚合物質例如縮水甘油進行的，所述可聚合物質允許部分結合到內部孔以及珠表面。最終的珠被描述為具有足夠降低的孔隙率，以防止分子量為3 kDa或更高的蛋白質滲透，并且填充有這些珠的柱已顯示最高可承受40巴的壓力。收縮方法的主要缺點是使用溶劑，例如二噁烷，其由于環境、健康和安全原因通常避免使用。

發明內容

本發明提供小的、剛性的和不可滲透的瓊脂糖珠，其適合于在高效液相色譜(HPLC)中作為固定相，用于分析生物分子，例如肽和蛋白質；并且還用于在更大規模中的制備性用途。

本發明提供固體瓊脂糖珠，并具有剛性以排除小至100g/mol的化合物，即基本上排除甚至最簡單的二肽。

在第一方面，本發明涉及固體瓊脂糖珠，其中所述瓊脂糖珠是剛性的，并且對于分子量低至3000g/mol，優選100g/mol的化合物是不可滲透的。

優選地，所述珠具有1-25μm的直徑，對于HPLC而言優選1-15μm，對于制備性應用而言優選15-25μm。

根據本發明的固體瓊脂糖珠承受超過100巴的壓力，優選≥300巴的壓力，用于高壓下的快速分析性應用和低壓下的更大規模的制備性應用。小珠-高壓。大珠-低壓。

優選地，固體瓊脂糖珠提供有觸角/接枝聚合物，以增加表面積并實現功能化。

觸角或珠表面可提供有配體，例如陽離子配體、陰離子配體、親和(蛋白A、IMAC)配體、疏水相互作用配體或其組合。

在本發明的一個實施方案中，固體瓊脂糖珠的直徑為1-15μm，并裝填在HPLC柱中。一個或多個HPLC柱可以連接至HPLC系統。當提供多于一個柱時，柱的珠優選具有不同的功能性(連接不同的配體)。