[發明專利]利用源自芽孢桿菌菌株的聚γ-谷氨酸合成基因的表面表達載體以及使用該載體在微生物表面表達蛋白的方法

在審

• 申請號: 201980041310.9
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN112334580A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 樸永鐵;全在原;樸洪圭;姜顯俊;邊世恩;樸光緒;奇大殷
• 申請（專利權）人: 生物領先公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N9/00
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 洪俊梅;張淑珍

本發明涉及具有用于編碼聚γ?谷氨酸合成酶的pgsA基因的表面表達載體、以及通過使用該載體在微生物表面表達靶蛋白的方法。將其中添加有外源基因的載體轉化微生物，并允許外源蛋白在微生物表面穩定表達。

技術領域

本發明涉及利用外膜蛋白(pgsA)在微生物表面表達外源蛋白的新載體，所述外膜蛋白(pgsA)源自Bacillus sp.菌株并參與聚γ-谷氨酸的合成。此外，本發明涉及通過利用外膜蛋白在微生物表面上表達外源蛋白來生產蛋白的方法，所述外膜蛋白源自Bacillussp.菌株并參與聚γ-谷氨酸的合成。

背景技術

細胞表面展示是指將蛋白質或肽與適當的錨定基序(anchoring motif)融合并在革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌、真菌、酵母或動物細胞的表面上表達的技術(Lee S.Y.等，Trends Biotechnol.，21:4552，2003)。根據1980年代開發的第一種細胞表面展示技術，使用具有相對簡單表面的噬菌體，將肽或小蛋白與絲狀噬菌體的pIII融合，并在噬菌體表面上表達。因此，細胞表面展示技術被稱為表面表達系統。將使用噬菌體的細胞表面展示用于抗體的抗體篩選或者表位、高親和力配體等的篩選，但是局限在于可在噬菌體表面上表達的蛋白質的大小相對有限。因此，作為其替代，已經開發出使用細菌的細胞表面表達。這是利用微生物(例如細菌或真菌)的表面蛋白作為表面錨定基序在微生物表面穩定表達外源蛋白的領域。

為了利用特定有機體的外膜蛋白在細胞表面表達外源蛋白，應通過將合適的表面蛋白和外源蛋白在基因水平上彼此連接來生物合成融合蛋白，并且它們應穩定地穿過內膜，并應保持錨定在細胞表面上。為此，優選使用具有以下性質的蛋白質作為表面錨定基序：首先，該蛋白質應在其N端具有能夠穿過內膜的分泌信號；第二，該蛋白質應具有可穩定地錨定至外膜表面的靶向信號；第三，該蛋白質應在不對細胞生長產生不利影響的范圍內在細胞表面上大量表達，以便使該蛋白質能夠表現出高活性；最后，該蛋白質無論其大小都應穩定表達，以便使其可用于各種反應(Georgiou等，TIBTECH，11:6，1993)。該表面錨定基序需要進行基因工程化，以將其插入宿主細胞表面上的外膜蛋白的N端或C端或者以將其插入該蛋白的中心(Lee等，TIBTECH，21:45，2003)。

為了使蛋白質在細菌表面上表達，能夠使在細胞中生物合成的蛋白質穿過細胞膜的分泌信號應位于蛋白質的一級序列上。另外，在革蘭氏陰性細菌的情況下，蛋白質應穿過內膜和周質空間，并應被插入和錨定至外膜，以便從膜上突出。

在細菌的情況下，具有這種分泌信號以及可穩定地錨定至細胞表面的靶向信號的蛋白質的實例包括表面蛋白、特殊的酶、毒素蛋白等。事實上，如果將這些蛋白質的分泌信號和靶向信號與適當的啟動子一起使用，則可在細菌表面成功表達蛋白質。

用于外源蛋白的表面表達的細菌表面蛋白可大致分為四種類型：細胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和細胞表面蛋白。至今，已嘗試使用主要存在于革蘭氏陰性細菌中的表面蛋白(例如LamB、PhoE、OmpA等)在細菌表面表達必需的外源蛋白。當使用這些蛋白質時，將外源蛋白插入到細胞表面上的突出環(protruding loop)中，因此從結構上來講可插入的蛋白質的大小受到限制。另外，由于待插入的外源蛋白的C端和N端應在空間上彼此靠近，因此存在當C端和N端之間的距離遠時要通過接頭肽使兩個末端彼此靠近的問題。

事實上，當利用LamB或PhoE來插入由50個-60個以上氨基酸或更多個氨基酸組成的外源多肽時，由于結構限制導致未形成穩定的膜蛋白[Charbit等，J.Immunol.，139：1658-1664(1987)；Agterberg等，Vaccine，8：85-91(1990)]。盡管也存在利用OmpA將外源蛋白插入突出環中的情況，但是為了克服結構限制，僅使用含有能夠錨定至外膜的最小靶向信號的OmpA片段。作為該方法，存在將β-內酰胺酶與OmpA靶向信號的C端連接并在細胞表面表達的情況。