[發明專利]成熟的氣道類器官、其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201980037552.0
• 申請日: 2019-05-31
• 公開（公告）號: CN112567023A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: J.周;袁國勇;C.李;M.C.邱;J.C.克萊沃斯
• 申請（專利權）人: 香港大學;荷蘭皇家科學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/02
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 牟科;鄒宗亮

提供了用于產生2D和3D分化的氣道類器官的方法、通過所述方法產生的2D和3D分化的氣道類器官以及所述2D和3D分化的氣道類器官的用途。

技術領域

本發明一般涉及氣道類器官，特別是分化的氣道類器官、制備和使用方法，特別是用于流感病毒研究。

發明背景

甲型流感病毒(IAV)可以感染多種禽類和哺乳動物物種(包括人類)，并且具有顯著的進化和適應新宿主的能力(1)。IAV的片段化RNA基因組和低保真度的RNA聚合酶允許抗原移位和漂移，其推動了這種進化。因此，來自禽類和豬的新病毒可以越過物種屏障并感染人類，導致散發性感染、流行病以及甚至大流行(Klenk,Cell Host Microbe 15(6):653-654(2014)；To,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013))。盡管在病毒學和流行病學方面取得了巨大進展，但仍無法預測哪種IAV的亞型或毒株將引起下一次爆發。2013年以來，來自禽類的新型重配H7N9流感病毒已在中國引起人類感染的反復爆發(To,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013)),Chen,et al.,Lancet 381(9881):1916-1925(2013))。根據世界組織報告，截至2017年10月，報告有超過1500例實驗室確診的H7N9人感染病例，病死率高于35％。2009年，21世紀的首次流感大流行是由一種新型大流行H1N1(H1N1pdm)引起的，其起源于“經典的”豬H1N1病毒與人H3N2病毒、禽病毒和禽樣豬病毒的多種重配(AVIT,et al.,N Engl J Med 360(25):2605-2615(2009))。雖然豬病毒僅偶發性地感染人類，但是這種新的豬源H1N1pdm病毒株可以建立持續的人際傳播，并從那時起就作為一種季節性病毒株在全球傳播。病毒糖蛋白血凝素(HA)的蛋白水解裂解對于IAV獲得傳染性至關重要，因為只有裂解的HA分子介導病毒和宿主細胞之間的膜融合，這是引發感染所需的過程。低致病性禽類IAV和人類IAV的HA蛋白在切割位點攜帶單個堿性氨基酸精氨酸(Bottcher E,et al.,J Virol 80(19):9896-9898(2006)；Bosch,et al.,Virology 113(2):725-735(1981))，被胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶識別。因此，這些病毒在人氣道中的有效感染需要絲氨酸蛋白酶，如TMPRSS2、TMPRSS4、HAT等(Bottcher-Friebertshauser et al.,Pathog Dis 69(2):87-100(2013))。然而，高致病性禽類病毒(諸如H5N1)的HA蛋白含有被廣泛表達的蛋白酶激活的多元切割位點。

目前用于研究人類呼吸道流感感染的體外模型涉及人肺外植體和原代氣道上皮細胞的短期培養。在常規基礎上人肺外植體不易獲得。此外，在感染實驗中原代組織的快速退化是主要問題。在氣-液界面條件下，分離自人氣道的基底細胞可極化并發生粘膜纖毛分化。然而，這種能力在2-3次傳代后就喪失了(Butler,et al.,Am J Respir Crit Care Med194(2):156-168(2016))。總之，這些原代組織和細胞幾乎不能構成研究人類呼吸道病原體的方便的、可再現的模型。盡管有各種細胞系(例如A549和MDCK)通常被用于繁殖流感病毒和研究病毒學，但它們很難再現人氣道上皮的組織學。此外，由于絲氨酸蛋白酶活性低，除非培養基中補充了外源絲氨酸蛋白酶：經N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)處理的胰蛋白酶，否則大多數細胞系不支持具有一元HA切割位點的流感病毒的生長。因此，為研究人類呼吸道的生物學和病理學，仍急需生物學相關的、可再現的和容易獲得的體外模型。