[發明專利]一種具有更高特異性的核酸擴增方法

在審

• 申請號: 201980028245.6
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN112074612A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 德米特里·切爾科索夫;克里斯蒂安·格倫沃爾德
• 申請（專利權）人: AGCT有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 陳燕嫻;何子睿

1.一種用于擴增核酸的方法(圖56)，其中：

·樣品包含第一核酸聚合物，該第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及與M1(反向)互補的序列M1’]，其中M在5’-3’方向包含連續的序列片段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，且在第一擴增步驟中與以下組分接觸：

·第一模板依賴性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依賴性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脫氧核糖核苷三磷酸)和合適的輔因子(尤其是鎂離子)；

·第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含連續的序列片段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有與M1.1互補[可基本上序列特異性地結合]的[雜交]序列，而序列區段P1.1.2不能與M1[或相對于序列M1緊隨3’方向上M1.1的序列]結合；

其中，P1.1(尤其是在區段P1.1.2中)包含修飾的核苷酸結構單元，使得P1.1.2不能用作第一模板依賴性核酸聚合酶活性的模板；

·第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其與M1.5(基本)相同[并且能夠序列特異性地與M1的反鏈上的M1.5的反向互補序列或P1.1的延伸產物P1.1-Ext(該處稱為P1.1E1)結合]；以及

·對照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含連續的序列片段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3與M1的區段M1.2相同，且區段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶啟動時首先被讀取，因此C1.2.3可以與引物P1.1-Ext的聚合產物結合]，C1.2.2與P1.1.1互補(且與M1.1相同)，而C1.2.1與P1.1.2互補；

其中，C1.2含有在C1.2.1中修飾的核苷酸結構單元，因此C1.2.1不能用作模板依賴性核酸聚合酶活性的模板；

其中，所述樣品在第二擴增步驟中與下列組分接觸：

c)第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列區段3.1.1[或基本上由3.1.1組成]，且與M1的M1.1(反向)互補[可以與P2.1-Ext互補地結合]；

d)第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列區段4.1.1[或基本上由4.1.1組成]，且與M1的M1.5相同和/或基本相同[可以與P1.1-Ext互補地結合]；以及

e)第二模板依賴性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可選地)模板依賴性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脫氧核糖核苷三磷酸)和合適的輔因子。

2.如權利要求1所述的用于擴增核酸的方法，其中獲得了第一引物延伸產物P1.1-Ext，其在5’-3’方向上除了序列區域P1.1.2和P1.1.1之外，還包括在5’-3’方向上包含序列片段P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2和P1.1E1的合成區域，其中P1.1E4與靶序列M1的序列區段M1.2基本互補，P1.1E3與M1.3基本互補，P1.1E2與M1.4基本互補，以及P1.1E1與M1.5基本互補，并且得到第二引物延伸產物P2.1-Ext，其除了序列區域P2.1.1之外還包含合成區域P2.1-Ext，其與所述靶序列M1基本相同，且所述靶序列M1所在的區域與3’方向上的M1.5相鄰；

其中：

-選擇所述第一擴增步驟的反應條件，以及/或者

-選擇P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果適用)的長度和/或解鏈溫度，

以使P1.1-Ext可以與M1或P2.1-Ext形成雙鏈，而P1.1-Ext可以與C1.2形成雙鏈，并且P1.1-Ext與C1.2形成的所述雙鏈優選于其與P2.1-Ext形成的所述雙鏈。

3.如權利要求2所述的用于擴增核酸的方法，其中：

-選擇所述第一擴增步驟的反應條件，以及/或者

-選擇P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果適用)的長度和/或解鏈溫度，

以使在沒有所述對照寡核苷酸C1.2的情況下，所述第一引物延伸產物P1.1-Ext根本或基本不與所述第二引物延伸產物P2.1-Ext分離。

4.如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于：所述修飾的核苷酸結構單元包括2’-O-烷基核糖核苷結構單元，尤其是2’-O-甲基核糖核苷結構單元。