[發明專利]散射輔助超定位顯微術方法及相關裝置

有效

• 申請號: 201980019390.8
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN111886491B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 馬可·萊奧尼蒂;朱塞佩·安東尼奧奇;雷諾·塞卡雷利
• 申請（專利權）人: 生命科學突破性技術進步有限責任公司;意大利技術學院基金會
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00
• 代理公司: 上海脫穎律師事務所 31259
• 代理人: 脫穎

一種熒光顯微術方法，包括以下步驟：A.用相干激發光束(5)照射包括一個或多個熒光發射體的散射樣品，相干激發光束的波前具有第一初始配置C¹以激發散射樣品中包括的一個或多個熒光發射體；B.通過像素成像單元(45)采集與散射樣品的背景圖像對應的第一初始圖像F¹，F¹＝F_B，從而獲得散斑顆粒圖像；C.選擇坐標為[x_N,y_N]的M個目標像素P_N，所述M個目標像素屬于第一初始圖像F¹的具有至少一個熒光發射體的熒光信號的區域，其中N＝1、…、M，M個目標像素P_N中的每個目標像素均具有第一初始強度I_PN¹；D.針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，優化波前的第一初始配置，以便減小第一初始圖像F¹的散斑顆粒尺寸，并且獲得散射樣品的具有熒光信號的局部最大值I_PN^最大的最終圖像F^最終(I_PN^最大)，所述局部最大值對應于目標像素P_N的最大強度；E.針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，從在步驟D獲得的最終圖像F^最終(I_PN^最大)中減去在步驟B獲得的背景的第一初始圖像F_B，針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，獲得僅具有從位于強度為I_PN^散斑的像素[X_N,Z_N]處的散斑顆粒而來的熒光信號的圖像F_散斑(PN)；F.針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，用具有自由中心坐標的高斯函數對在步驟E中獲得的圖像F_散斑(PN)進行擬合，從而獲得xy平面中的坐標(X_N,Z_N)和強度I_N；G.針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，生成包含高斯分布的圖像F_N，所述高斯分布以在步驟F中獲得的坐標(X_N,Z_N)為中心并且具有強度I_N、并且具有等于散射樣品的平均散斑顆粒尺寸S的束腰；H.針對M個目標像素P_N中的每個目標像素，通過對在步驟G獲得的M個圖像F_N求和來生成樣品的最終圖像。

本發明涉及一種以簡單、可靠、適應性強且經濟的方式增加熒光顯微術裝置對不透明或散射樣品的光學分辨率而不增加裝置復雜性的方法。

這種方法利用樣品本身散射的光來增加顯微術裝置的有效數值孔徑，從而克服了所使用的光收集光學系統(即物鏡)的分辨率。這種方法基于散射樣品上激發相干光束的波前相位和/或振幅調制，以從由樣品散射的光束中建立相長干涉，從而產生緊密的聚焦，并且這種方法基于對由樣品散射的光的控制。具體地，根據本發明的方法使由生物組織的熒光蛋白發出的熒光信號的強度最大化，并且將在反復優化后從在遍及樣品的不同位置產生的多個焦點產生的熒光中獲得的信息集合成圖像，該圖像的分辨率不受照明和收集光學器件的限制。

進一步地，本發明涉及一種光學分辨率提高的熒光顯微術裝置。

盡管本發明主要面向生物學樣品的探究，其中實驗條件要求將熒光信號收集光學器件定位成遠離樣品，但是必須記住，在其他領域例如天文和大氣，或出于安全或民用目的而進行的遠距離調查，本發明可以應用于由其他散射樣品產生的熒光信號，仍處于所附權利要求所定義的保護范圍之內。