[發明專利]用于基于酶相互作用持續時間選擇多核苷酸的方法

在審

• 申請號: 201980007234.X
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN111615560A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 安德魯·約翰·赫倫;瑞貝卡·維多利亞·鮑恩
• 申請（專利權）人: 牛津納米孔技術公司
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 楊文娟;臧建明

一種用于選擇多核苷酸的方法，所述方法包括：允許核酸處理酶沿樣品中的多個多核苷酸移動限定的時間段，其中將所述酶加載到所述多個多核苷酸的每一個上，并且其中所述酶的一個或多個分子沿所述多個多核苷酸中的每一個移動；并基于在所述限定的時間段內所述酶是否到達所述多核苷酸的末端和/或與所述多核苷酸解結合來選擇多核苷酸。

技術領域

本發明一般涉及選擇多核苷酸的方法。本發明一般還涉及修飾、分離和/或表征所選多核苷酸的方法。

背景技術

基于大小選擇多核苷酸對于許多應用如DNA和RNA的測序是重要的。在廣泛的應用中需要快速和廉價的多核苷酸表征、鑒定、擴增和測序技術。多核苷酸的長度可有助于鑒定多核苷酸。多核苷酸的長度和完整性也可影響下游鑒定、擴增或測序應用的成功和快速性。為了最佳性能，許多高通量DNA測序儀需要一定大小的插入物文庫。其中多核苷酸大小選擇對其具有重要性的應用的其它實例包括確保正確的PCR產物形成、基因分型、DNA指紋分析、基因譜分析和提取限定大小的片段，例如在酶促消化多核苷酸之后。

不同大小的DNA常規通過凝膠電泳檢測。手動凝膠電泳方法有許多缺點，并且已經開發了分離和選擇所需大小范圍在100bp至50kb的DNA的自動化電泳儀器。

官能化的順磁性二氧化硅顆粒和聚乙二醇(PEG)在不同反應條件下可用于DNA大小選擇。通常，這些方法只允許分離長度1kb的DNA。也可使用利用固體基質的大小排阻方法，但同樣，這些方法通常用于從1000kb+片段中去除短的1kb的DNA片段。

發明內容

本發明人設計了一種基于酶的在包含多個多核苷酸的樣品中選擇多核苷酸的方法。本發明人已經認識到，核酸處理酶沿多核苷酸長度的移動速度是一致的，并且不取決于多核苷酸的長度。本發明人利用核酸處理酶的這一特性設計了方法，其中利用核酸處理酶的移動來選擇不同長度的多核苷酸。所述方法包括基于在預定的時間段之后酶是否保持與多核苷酸結合，和/或基于酶是否到達末端和/或從多核苷酸上脫落來選擇多核苷酸。所述方法可用于選擇所需長度的多核苷酸。所述方法也可用于選擇未受損的多核苷酸和/或完整的多核苷酸。所述方法的另一個用途是從僅在一端包含銜接子的多核苷酸和/或從未銜接的多核苷酸中選擇在兩端包含銜接子的多核苷酸。

因此，本文提供了一種用于選擇多核苷酸的方法，所述方法包括：

(i)允許核酸處理酶沿樣品中的多個多核苷酸移動限定的時間段，其中所述酶被加載到所述多個多核苷酸中的每一個上，并且其中所述酶的一個或多個分子沿所述多個多核苷酸中的每一個移動；以及

(ii)基于在所述限定的時間段內所述酶是否到達所述多核苷酸的末端和/或與所述多核苷酸解結合來選擇多核苷酸。

所述樣品可以例如包含PCR反應的產物；基因組DNA；內切核酸酶消化的產物；或DNA文庫。

所述方法可以包括以下中的一個或多個：

-選擇性修飾所需長度的多核苷酸或選擇性修飾非所需長度的多核苷酸；

-選擇性修飾未受損的多核苷酸或選擇性修飾受損的多核苷酸；

-選擇性修飾完整的多核苷酸或選擇性修飾帶切口的多核苷酸；

-將所需長度的多核苷酸與其它多核苷酸分離；

-將未受損的多核苷酸與受損的多核苷酸分離；

-將完整的多核苷酸與帶切口的多核苷酸分離；

-表征所需長度的多核苷酸、未受損的多核苷酸和/或完整的多核苷酸；

-對所需長度的多核苷酸、未受損的多核苷酸和/或完整的多核苷酸進行測序；

-從所需長度的多核苷酸、未受損的多核苷酸和/或完整的多核苷酸中除去引物或銜接子；以及