[發明專利]一種基于廣譜檢測的生物分子檢測方法及裝置

在審

• 申請號: 201911423756.6
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111041075A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 陳云玲;趙丹;臧明麗;高進勇;李歡;張帆
• 申請（專利權）人: 信陽學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12M1/34;C12M1/00
• 代理公司: 哈爾濱華夏松花江知識產權代理有限公司 23213
• 代理人: 侯靜

一種基于廣譜檢測的生物分子檢測方法及裝置，是利用了酶免吸附原理制作了親和試劑，用親和試劑純化了待檢的樣品，然后放入了平行多元的反應器(生物芯片)中與固化引物結合，再進行PCR擴增，是貫通了ELISA、生物芯片、PCR技術集合了其優勢，能同時檢測多種核酸、蛋白質或其它生物大分子，提高了檢測精度和效率，減少了檢測樣品和工序，對樣品的處理簡化使操作和使用更加簡便。本方法可對人體、動植物、微生物、食品、環境等進行檢測，用于疾病診斷、食品檢測、商檢、環保評估檢疫等。

技術領域

本發明涉及一種生物檢測技術，更具體地說涉及一種定性定量檢測核酸、蛋白質及生物大分子的檢測方法。

背景技術

生物大分子除核酸和蛋白質外，還包括糖類和脂類物質，還可包括其它存于生物體的有機物以及這些物質的結合產物。生物檢測是對生物大分子進行檢測或是通過生物大分子對生物體進行檢測，生物的檢測是一種定性或定量的分析。定性分析，檢測生物的種類、種群或變種或某種特殊的抗原或基因序列或其它生物大分子的存在，例如鑒定含轉基因的動植物；定量分析，檢測物種的數量或濃度，或某種細胞或病毒或分子的濃度，測定的方法可以是細胞培養計數方法、血清免疫方法以及核酸擴增方法等，細胞培養計數方法(培養、分離、鑒定)為直接方法，無需標準樣，其它為間接方法，需要有相應的標準樣作對照。核酸是生物物種的遺傳物質，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補核酸鏈，互補的核酸鏈可形成穩定的雙鏈結構，由互補的兩單鏈分子結構形成雙鏈分子結構的過程稱為分子雜交。非完全互補的核酸鏈(部分互補)在特定條件下也會形成雙鏈分子結構。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復制出互補的核酸鏈，在復制過程中，被復制的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補鏈，逆轉錄酶以RNA為模板合成DNA互補鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補，并可與其雜交形成雙鏈結構。核酸聚合酶反應的始點決定于引物的位置，DNA的聚合反應從引物地3’末端開始(DNA及cDNA聚合反應)。RNA聚合酶反應需要有雙鏈的被RNA聚合酶識別的結構，稱為驅動子。引物核酸片段可以由幾個或幾十個堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過降解自然核酸而取得的片段，也可以通過人工化學合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結構)，非自然的組成單位(結構)包括在自然界中不是核酸組分的結構，也包括不存在于自然界的化學結構。通過引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復制以及模板分子的擴增。DNA可以在聚合酶等的作用下被復制，即由模板鏈復制出互補鏈，DNA的復制需要有一引物，引物一般為一含有幾個或幾十個堿基的核酸鏈，核酸復制前引物與模板在3’端有特異性地根據堿基配對原理結合成雙鏈結構(這一過程稱為分子雜交)，此后聚合酶可從引物的3’端開始沿5’→3’方向合成與模板相互補的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(＞90℃)分離成獨立的單鏈，當溫度下降時余下的引物分子可再與相應的模板核酸分子雜交，并可在聚合酶的作用下復制出新的核酸鏈，反復如上過程，一個核酸片段可被擴增出大量相同的分子片段，如上過程即為聚合酶鏈反應過程(PCR)。另外一種擴增方法為轉錄反應，即把一個帶驅動子的DNA分子轉錄成多個RNA分子，然后可把所產生的RNA分子再逆轉錄成多個DNA分子。一核酸樣品需擴增的部分為靶片段，進行PCR反應一般在靶片段兩端要有相應的引物。靶物或靶分子即被檢查的物質或分子(蛋白、核酸、多糖等)或是一化學反應中所需探明的物質。基因芯片是一種把不同核酸分子分別排列于特定位置，并用于核酸分子雜交的裝置，固定于基因芯片上的核酸分子為探針分子，與探針分子進行特異性雜交的為靶分子，根據探針分子及標記在芯片的位置可對靶分子進行識別，標記可有多種形式，如放射性標記、熒光標記、納米顆粒標記、酶標記、色素標記等，用以區別不同基因型的核酸探針分子為基因型探針。由引物引發的聚合反應或擴增反應常用于分子生物學的基礎研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學相關的檢測。RNA包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA，mRNA為信使RNA，作為蛋白質合成的模板，帶有指導蛋白質合成的密碼，rRNA為核糖體RNA，是蛋白質合成過程中所需的核糖體的組成部分，tRNA為轉移RNA是用于識別mRNA上的密碼并攜帶相應氨基酸的RNA，基因組RNA為病毒RNA。細菌中的(不包括病毒)rRNA有如下特點①一細胞內有大量的rRNA，當用rRNA作為靶物(靶分子)時，可以提高檢查的靈敏度；②不同的微生物種類在rRNA結構上有差異，因此也可根據rRNA的序列進行微生物(細菌、真菌)的物種鑒別(識別)。對RNA(包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA)進行擴增前，必須把RNA逆轉錄成cDNA，cDNA是在逆轉錄酶的作用下，用RNA做為模板所合成的DNA鏈，cDNA可用常規的PCR方進行擴增。核酸擴增前需進行提取，或叫純化，RNA的提取出方法與DNA的提取有差異，具體方法為已知技術。抗原是一類能刺激人或動物機體產生抗體，并能與這些抗體在體內或體外發生特異性結合反應的物質。抗體是由抗原刺激人體或動物體的B細胞，由B細胞轉化成漿細胞所產生的具有特異性的免疫球蛋白。特異性，即專一性或選擇性，或非隨機性，但這種特異性在生物化學反應中不一定是絕對的，一般要根據反應的條件和對結果的要求而定。通過化學偶連可把核酸片段連接到抗體或抗原，因此通過對與核酸片段相偶連的抗原或抗體進行特異性富集，可提取到相關的核酸片段。在應用中，所需要的試劑為反應試劑，要進行混合然后在試管或其他反應器中進行反應。在一組或多個反應中反應試劑根據反應性質可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專一試劑，如核酸引物、抗體及酶等。一種反應試劑在某個反應中可能是專一試劑，在另一反應中可能是通用試劑。一般來說通用試劑指的是同一批的多個反應中的共同試劑，專一試劑是多個反應中，個別反應所需的試劑。另外反應中可以加入添加劑，添加劑在反應中不參與反應。常用的添加劑包括蛋白質(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會影響酶反應。添加劑的特性包括溶于水后會膨脹并可形成膠狀物態，可起到膠合劑作用；去水后會收縮、結塊，也可以固化，形成固化物。在有些反應中也可使用親和分子，或叫親和物，即一種有機分子或有機物，它對另一種有機分子(物)有特異性(或專一性)的親和結合能力。抗體可以是抗原的親和物。對大多數微生物或生物大分子都能找到或制出相應的抗體蛋白，這些抗體可以用來富集、識別和檢測相應的微生物或生物大分子，親和分子也可是核酸分子，一核酸片段與另一核酸片段有互補序列(能相互雜交)，則其中一種核酸片段可以是另一種核酸片段的親和分子(物)，被認識的叫靶分子。親和物(分子)可與相應的靶物(如細菌)或靶分子(如核酸或蛋白質或其它生物大分子)結合，親和物(分子)也可連接到含鐵或具順磁性(能被磁力吸引)物體的微顆粒表面，在磁力的作用下可將被檢樣品中靶物(靶分子)分離出來。靶分子(物)可以通過特異性反應與另一分子結合，然后通過對后者的測定來檢測原靶分子(物)，后者可定義為原靶分子(物)的派生靶分子，因此靶分子(物)包括原靶分子(物)和派生靶分子(物)。已有的生物檢測方法有細胞培養計數方法，這種方法檢測周期長，人工操作工作量大，易出錯。免疫學方法主要是利用抗體可以特異地與抗原分子結合，通過抗原抗體的特異性識別反應來進行檢測，已有技術中有許多不同的方法來檢測抗體與其目標抗原的結合，酶聯免疫吸附測定(ELISA)就是其中的一種方法，ELISA是一種在固相載體上進行的酶免疫反應，在酶聯免疫測定過程中，抗體上通常還連接有一種酶，如堿性磷酸酶等，這些酶能夠催化一種化學反應將無色底物轉化為有色物質，通過顏色的變化就能判斷出被測樣品中是否含有目標分子(靶分子)，常用的ELISA有直接型、間接型、雙抗體夾心型等。液相蛋白定量技術(CBA)的基本原理近似于ELISA的檢測，即利用微小、分散的顆粒捕獲液體待測物，并利用流式細胞儀檢測類似“三明治”的顆粒所散發的熒光，從而測定待測物的數量。免疫學方法(ELISA等)對定性定量的檢測快速簡單，但不足是測量通量低，靈敏度較低。由于PCR擴增的高度靈敏性，有時會出現假陽性擴增，因此常常使PCR與其它技術結合，目前常用的PCR種類有：普通PCR、槽式PCR、實時定量PCR、PCR-ELISA等，PCR反應具有高度特異性和敏感性，只需對少量的DNA進行測定便可檢測靶分子，但對實驗技術的要求很高，其結果易受許多因素的干擾而產生誤差。PCR反應一般在反應管中進行，也可以在平面反應器的微型不透孔或微管中進行。生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片以及其它形式的芯片。在已有的生物芯片方法中，蛋白質芯片與酶免方法相關，但其不能檢測核酸；基因芯片與PCR方法相關，但其需進行分子雜交并且不能檢測蛋白，而且常規生物芯片方法的樣品處理方法較麻煩。納米材料技術是新興起的技術，可用納米材料作為檢測生物分子的載體制成親和分子進行分子檢測，如制作成金標試紙可以直接快速檢測病毒等。已有的免疫學方法(ELISA)，納米技術方法、生物芯片、核酸擴增方法(PCR)等生物檢測技術各有優缺點，已有的技術組合中有將以上生物檢測技術中的二種進行了組合，如PCR-ELISA方法，但沒有一種能夠貫通四大生物檢測技術，集合其優點的方法。