[發明專利]一種以發根農桿菌介導的花煙草毛狀根誘導轉化方法

在審

• 申請號: 201911422861.8
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111269931A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 江龍;盧錫鋒
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/82
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 程新敏

本發明公開了一種以發根農桿菌介導的花煙草毛狀根誘導轉化方法，包括如下步驟：利用乙醇和次氯酸鈉消毒花煙草種子，轉接到MS固體培養基中，待60d后發育成無菌苗。制作發根農桿菌A4的侵染液，切下花煙草幼嫩子葉浸入該侵染液中，7?15d后長出毛狀根，利用抗生素進行抑菌、除菌后擴繁。本發明方法適用于多種花煙草的毛狀根誘導，具有取材方便、誘導率高、遺傳穩定等優點。

技術領域

本發明涉及農業生物技術研究領域，特別是涉及一種以發根農桿菌介導的花煙草毛狀根誘導轉化方法。

背景技術

花煙草（Nicotiana alata Link et Otto）隸屬茄科（Solanaceae），煙草屬（Nicotiana L）多年生草本植物，常作為盆栽養殖，具有很高的觀賞價值。在我國哈爾濱、北京、南京等市有引種栽培。是研究基于S-核酸酶自交不親和反應的重要材料?；煵萜淙旧w（2n=18）與普通煙草(2n=48) 具有很明顯的細胞學特征，可作為組織培養及細胞雜交的實驗對象（李向輝等，花煙草原生質體的再生植株，遺傳，1982）。

發根農桿菌(Agrobaeterium rhizogenes)A4，是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)農桿菌 (Agrobactefium)一類G-土壤桿菌，天然農桿堿型。可以侵染多數雙子葉植物和少數單子葉植物。發根農桿菌的Ri質粒通過T-DNA轉移到被侵染植物中，使其生成毛狀根。而植物在受到傷害后體內會分泌出一種酚類物質，能激活vir基因，促使Ri質粒轉入到植物細胞中，因此在侵染液中加入乙酰丁香酮（As）可增強轉化率。

花煙草具有很高的觀賞價值，同時具有很明顯的細胞生物學特征，作為細胞雜交的重要實驗研究材料，目前國內尚未有利用發根農桿菌誘導花煙草產生毛狀根的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供本發明提供一種以發根農桿菌介導的花煙草毛狀根誘導轉化方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種以發根農桿菌介導的花煙草毛狀根誘導轉化方法，包括以下步驟：

步驟一、花煙草無菌苗的獲得

將花煙草種子用洗潔精侵泡、再流水沖洗，于超凈工作臺用75%乙醇處理45-60s，無菌水沖洗2次，10% NaClO消毒8-13min，再用無菌水沖洗2次，置于MS培養基上培養；

步驟二、侵染液的制備

在含有100mg/L Kan 的YEP固體培養基上劃線分離發根農桿菌A4，28℃暗培養2-3天，挑單菌落入100mg/L Kan 的YEP液體培養基中28℃、180rpm二次活化，當菌液OD600值達到0.6-0.8時，凝膠電泳進行PCR檢測rol B基因；若菌液中存在rol B基因，則離心去上清液，轉入到MS液體培養基中，加入100μmol/L乙酰丁香酮混勻后獲得侵染液；

步驟三、毛狀根的獲得

（1）花煙草葉片預培養

當花煙草生長2-3月時，選擇長勢較好的花煙草植株，切取其葉片，切掉葉尖、葉基、葉緣，留取1.5cm*1.5cm的葉片，放入MS固體培養基中預培養2d；

（2）花煙草葉片的侵染及共培養

預培養后的花煙草葉片侵入制備好的侵染液中，侵泡8-10min后用無菌濾紙吸取多余菌液，置于MS固體培養基中25℃暗培養2d；

（3）花煙草葉片抑菌培養

2-3d后轉到含500mg/L頭孢霉素固體培養基中抑菌培養，5-7d轉接一次，15-20d左右在葉片邊緣將長出毛狀根。

（4）花煙草毛狀根的除菌培養及擴繁