[發明專利]一種HPLC-MS/MS法測定犬血漿中Rutin和Ombuoside的濃度的方法

在審

• 申請號: 201911420882.6
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111189936A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 王櫻桃;胡玲華
• 申請（專利權）人: 安領生物醫藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州隆恒知識產權代理事務所(普通合伙) 32366
• 代理人: 周子軼

1.一種HPLC-MS/MS法測定犬血漿中Rutin和Ombuoside的濃度的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)儲備液的配置：對Rutin、Ombuoside和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分別用甲醇溶解，配置得到Rutin儲備液、Ombuoside儲備液和Osalmide儲備液，≤-15℃密閉，遮光保存，其中Osalmide作為內標；

校正標示樣品工作液的配置：將所述Rutin儲備液和所述Ombuoside儲備液分別用甲醇-水溶液稀釋成濃度為4*10⁵、3.2*10⁵ng/mL的所述校正標示樣品工作液，將等濃度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀釋成梯度濃度400～8*10⁴ng/mL的所述校正標示樣品工作液；

質控工作液的配置：將所述Rutin儲備液和所述Ombuoside儲備液分別用甲醇-水溶液稀釋成濃度為3*10⁵ng/mL的質控工作液，將等濃度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀釋成梯度濃度400～2*10⁵ng/mL的所述質控工作液；

內標工作液的配置：將所述Osalmide儲備液用甲醇-水溶液稀釋成濃度為200、50ng/mL的所述內標工作液；

校正標示樣的配置：將所述校正標示樣品工作液用空白基質稀釋成梯度濃度為20～2*10⁴ng/mL的所述校正標示樣，所述空白基質為不含所述分析物與所述內標的犬血漿；

質控樣品的配置：將所述質控工作液用所述空白基質稀釋成濃度為20～1.5*10⁴ng/mL的所述質控樣品；

(2)樣品處理：取等體積的所述校正標示樣和所述質控樣品，并分別加入370μL所述內標工作液，渦旋離心后取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，渦旋混勻后取0.5μL在高效液相質譜聯用儀(HPLC-MS/MS)上進樣分析；

(3)標準曲線的制作：以Rutin比內標Osalmide、Ombuoside比內標Osalmide的色譜峰面積比為縱坐標，以犬血漿中Rutin、Ombuoside的濃度為橫坐標制作標準曲線；

(4)定量分析：根據步驟(2)對待測樣品進行處理，并按照步驟(3)所得所述標準曲線計算得到所述待測樣品中的Rutin、Ombuoside的濃度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中高效液相質譜聯用儀的工作條件為：

(1)色譜條件為：

色譜柱：ACE C18(2.1mm x 50mm,5AQ),ACE，柱溫為40℃；

自動進樣器溫度：8℃；

流動相A：0.2％乙酸水溶液；

流動相B：0.2％甲醇溶于甲醇-乙腈溶液；

進樣器清洗液：R0:MeOH/H2O(30/70，v/v)；R3:MeOH；

洗脫方式：梯度洗脫；

(2)質譜條件為：

質譜儀：AB SCIEX API5000 LC/MS/MS system；

離子源：ESI電噴霧電離；

離子化模式：Positive；

檢測模式：MRM多反應監測；

渦旋離子噴霧溫度：550℃。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，利用等濃度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀釋成的所述校正標示樣品工作液的梯度濃度分別為80000、32000、3200、800、400ng/mL；利用等濃度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀釋成的所述質控工作液的梯度濃度分別為2*10⁵、1.2*10⁴、1200、400ng/mL；所述校正標示樣的梯度濃度分別為2*10⁴、1.6*10⁴、4*10³、1.6*10³、160、40、20ng/mL；所述質控樣品的梯度濃度分別為1.5*10⁴、1*10⁴、600、60、20ng/mL。