[發明專利]一種檢測TSWV的速測卡及其制備、使用方法

在審

• 申請號: 201911418774.5
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111077317A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 賈蒙驁;郭玉雙;王亞琴;張孝廉;趙會納
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院;浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 張行超

本發明涉及一種免疫金標速測卡，應用雙抗體夾心免疫層析的原理，檢測植物樣本中的番茄斑點枯萎病毒TSWV。檢測時，首先向加樣孔中加入待檢樣本，如果樣本中含該病毒，在樣本層析移動的過程中，病毒會與金標墊上的膠體金標記的特異性單克隆抗體結合，然后被NC膜相應病毒檢測線（T線）上的抗體沉積，相應病毒的檢測線（T線）顯色，多余的金標單克隆抗體在繼續移動過程中被控制線上的二抗沉積，控制線（C線）顯色；如果樣本中不含上述病毒，則檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色。應用該速測卡可現場對各種樣品中TSWV進行準確、快速和靈敏的檢測。

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的速測卡及其使用方法，具體是一種檢測番茄斑點枯萎病毒（TSWV）的速測卡及其制備、使用方法。

背景技術

番茄斑點枯萎病毒（TSWV）為顆粒球狀，直徑70-99nm，外面有一層脂蛋白雙膜。病毒很不穩定，體外存活期僅56小時，除花生外，該病毒還侵染番茄、煙草、馬鈴薯、茄子、辣椒、萵苣、菠蘿等。

TSWV侵染引起花生芽枯病等植物病癥，患病植株頂端葉片出現很多伴有壞死的褪綠環斑或黃斑，常沿葉柄或頂端表皮下的維管束變為褐色壞死或導致頂端枯死，頂端生長受抑，嚴重的節間短縮、葉片壞死，植株矮化明顯。

目前常規檢測TSWV的方法為PCR，需要專門的實驗室場地，需要借助專門的儀器設備，并且對操作人員要求較高，需要有相當的專業知識、技能和操作經驗，檢測過程前處理復雜，所需時間很長。

以層析流動為檢測原理的金標卡檢測方法已在很多領域中有過應用，包括食品安全檢測、植物轉基因檢測等，但針對煙草病毒的檢測較少，而同時檢測PVY和CMV等的速測卡還未見有公開報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種的速測卡及其制備、使用方法，并應用其針對葉片樣品中TSWV進行快速、現場和靈敏的檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種檢測番茄斑點枯萎病毒TSWV的速測卡，包含：底板上依次粘貼的樣品墊、金標墊、NC膜以及吸收墊，所述的金標墊固定有膠體金標記的TSWV單克隆抗體，所述的NC膜有一條檢測線，固定TSWV特異性多克隆抗體。

所述的TSWV單克隆抗體由分泌TSWV單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備得到。

所述的金標墊上單克隆抗體的量為5 ng-50 ng，優化的量為48ng；NC膜上多克隆抗體的量為0.4μg-1.2μg，優化的量為0.6μg。

分泌TSWV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏編號為CCTCC NO:C2019179。

還包括封蓋板，所述的封蓋板設置加樣孔和結果觀察孔，加樣孔對應樣品墊的位置，結果觀察孔對應金標墊和NC膜位置。

所述的一種檢測番茄斑點枯萎病毒TSWV的速測卡的制備方法，（1）將TSWV的特異性多克隆抗體和二抗分別固定于NC膜上；（2）在堿性條件下將膠體金顆粒與抗TSWV特異性單克隆抗體通過靜電作用力相互結合；（3）速測卡的組裝：底板上依次粘貼的樣品墊、金標墊、NC膜以及吸收墊，加蓋封蓋板與底板合并形成速測卡。

所述的一種檢測番茄斑點枯萎病毒TSWV的速測卡的使用方法，首先于加樣孔中加入樣品溶液并水平放置，1min后，于結果觀察孔中觀察顏色變化，作出判斷；如果只有控制線C線，沒有相應的檢測線T線，則表明為待檢物質為陰性；既有控制線C線，又有相應的檢測線T線，則表明待檢物質為陽性。