[發(fā)明專利]一種基于單腫瘤樣本高通量測(cè)序微衛(wèi)星不穩(wěn)定性探測(cè)位點(diǎn)篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911414501.3
• 申請(qǐng)日: 2019-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN110910957B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫大偉;柳毅;段小紅;承康平;周啟明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 求臻醫(yī)學(xué)科技（浙江）有限公司
• 主分類號(hào): G16B20/20
• 分類號(hào): G16B20/20;G16B20/30;G16B25/10;G16B45/00
• 代理公司: 重慶百潤洪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50219
• 代理人: 陳付玉

本發(fā)明公開了一種基于單腫瘤樣本高通量測(cè)序微衛(wèi)星不穩(wěn)定性探測(cè)位點(diǎn)篩選方法，該方法基于優(yōu)化后的微衛(wèi)星位點(diǎn)狀態(tài)標(biāo)志，采用機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，通過對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行建模分析，利用有效位點(diǎn)被判別為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)的百分比來探測(cè)每個(gè)樣本是否為微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)只利用腫瘤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)來探測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)，能夠高精度判斷多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)基因檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于單腫瘤樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性探測(cè)位點(diǎn)篩選方法。

背景技術(shù)

近年來，人類基因組測(cè)序技術(shù)在疾病，健康，衰老等方面的應(yīng)用越來越廣泛，隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，特別是下一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床診斷。下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)明使得測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量兩個(gè)特點(diǎn)，使得測(cè)序價(jià)格越來越低。除了下一代測(cè)序技術(shù)，目前單細(xì)胞測(cè)序也為人類在微觀層面上觀測(cè)人類基因組序列信息提供了更多的便利。

目前，腫瘤已經(jīng)成為中國主要死亡原因且腫瘤負(fù)擔(dān)仍在持續(xù)上升，發(fā)病率也在逐年增大，為了減少死亡率，減輕患者的痛苦，精準(zhǔn)醫(yī)療與個(gè)體醫(yī)療顯得十分重要，通過單腫瘤樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性探測(cè)個(gè)體化用藥也隨之成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢(shì)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Micro-Satellite?Instability?,?MSI）是指脫氧核糖核苷酸（DNA）復(fù)制過程中由于重復(fù)序列非正常插入或移除導(dǎo)致微衛(wèi)星等位基因長度發(fā)生變化，且該變化因?yàn)镈NA錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制的基因發(fā)生啟動(dòng)子甲基化抑制基因表達(dá)或發(fā)生失活、截短突變）無法通過DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（Mismatch?Repair?System,?MMR）進(jìn)行修正等種種原因。當(dāng)細(xì)胞中與DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)的基因發(fā)生突變或者異常表觀修飾而失活時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Microsatellite?Instability，MSI）的表型。大量研究表明，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并在腫瘤的治療和預(yù)后的過程中具有重要的作用。因此，選擇合適的基于單腫瘤樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性探測(cè)位點(diǎn)篩選方法具有非常重要的意義。

目前臨床中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)方法主要依賴于美國腫瘤研究所制定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即檢測(cè)兩個(gè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)（BAT-25，BAT-26）和三個(gè)二核苷酸重復(fù)位點(diǎn)（D2S123，D5S346，D17S250）共五個(gè)基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性。這種方法通過PCR擴(kuò)增然后通過電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)比腫瘤樣本和正常對(duì)照樣本在目標(biāo)重復(fù)區(qū)域的拷貝數(shù)情況來決定微衛(wèi)星位點(diǎn)的穩(wěn)定性。根據(jù)檢測(cè)樣本中不穩(wěn)定性位點(diǎn)占總檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)的比例可以將樣本微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)確定為高不穩(wěn)定（MSI-H），低不穩(wěn)定（MSI-L）和穩(wěn)定（MSS）三種狀態(tài)。這種檢測(cè)方法檢測(cè)位點(diǎn)過少，實(shí)驗(yàn)方案復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長，且只能檢測(cè)限定的標(biāo)志物。

隨著二代測(cè)序（NGS）在腫瘤生物學(xué)的深入拓展，一些計(jì)算機(jī)算法已經(jīng)開發(fā)用NGS數(shù)據(jù)來確定MSI的狀態(tài)。計(jì)算機(jī)算法，例如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析軟件MSIsensor,?MANTIS和mSINGS是通過檢查來自正常和腫瘤配對(duì)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)計(jì)算不穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn)的占比。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析軟件MSIseq，MOSAIC和MIRMMR使用了基于微衛(wèi)星突變位點(diǎn)，甲基化和其他微衛(wèi)星特點(diǎn)的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器。MOSAIC和MSIseq通過處理更小但是微衛(wèi)星特點(diǎn)更集中的文件（樣本重復(fù)區(qū)域中觀察到的每兆區(qū)域的微插入微缺失）來對(duì)MSI數(shù)值進(jìn)行評(píng)估。MSIsensor是一款在腫瘤/正常組織（Tumor-normal）基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中定量MSI的軟件，它識(shí)別人類基因組中對(duì)應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)的體細(xì)胞突變狀態(tài)。MSIsensor的性能已經(jīng)得到紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心（MSKCC）在15000例實(shí)體瘤中的驗(yàn)證，已投入日常的醫(yī)療檢測(cè)。

盡管MSI檢測(cè)如今越來越成為許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的常規(guī)項(xiàng)，但是在實(shí)際的臨床操作中，配對(duì)的正常樣本并不在樣本采集的日常要求；同時(shí)，相匹配的非腫瘤組織可能很難在臨床操作中獲取。腫瘤/正常組織配對(duì)（Tumor-normal?paired）分析，即使是正常組織采用低深度測(cè)序，依然會(huì)造成成本的顯著上升。不僅如此，如果配對(duì)的正常樣本來自血液或是唾液，腫瘤/正常組織分析無法捕捉到樣本保存和核酸提取的系統(tǒng)噪音。