[發明專利]一種檢測血液中HBV pgRNA的試劑盒

在審

• 申請號: 201911407131.0
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111057791A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 郭文滸;袁青;林碧宇;薛怡婷
• 申請（專利權）人: 阿吉安（福州）基因醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州市博深專利事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 段惠存

本發明公開了一種檢測血液中HBV pgRNA的試劑盒，屬于分子生物學技術領域，試劑盒包括擴增試劑，擴增試劑包括PCR反應液Ⅰ，PCR反應液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探針。本發明提供的試劑盒，利用RNA單鏈需逆轉錄的特點，在逆轉錄引物的5’端增加一段特異的非HBV的序列，同時將合成該段序列的寡核苷酸作為cDNA擴增的引物，達到特異性擴增pgRNA的目的，檢測過程中不受DNA干擾，有效提高了試劑盒檢測時的靈敏度，對乙肝病毒pgRNA的檢測下限可達10copies/ml。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種檢測血液中HBV pgRNA的試劑盒。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起肝臟疾病，如肝硬化和原發性肝癌，最常見的病因之一。全球超過20億人感染了乙肝病毒，約有2.4億慢性乙型肝炎患者，我國約有9300萬慢性乙肝病毒攜帶者，其中發展為慢性乙型肝炎的患者約2000～3000萬人。

乙型肝炎病毒屬于嗜肝性DNA病毒，病毒侵入人體后，通過preS1區域與肝細胞膜上鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白受體結合，脫去包膜后進入肝細胞質，釋放松環DNA(rcDNA)進入肝細胞核，在肝細胞核中rcDNA轉變成共價閉合環狀DNA(cccDNA)，再以cccDNA為模板轉錄出4種mRNA，其中長度3.5Kb的前基因組RNA(pgRNA)包含HBV DNA上的所有遺傳信息，并且pgRNA能夠在胞質中逆轉錄形成rcDNA和病毒蛋白，最后裝配成完整的HBV，釋放至肝細胞外，而一部分rcDNA進入細胞核中，再轉變成cccDNA，形成乙肝病毒持續復制的過程。

cccDNA能以游離的形態長期穩定存在于肝細胞核中，所以cccDNA的水平與乙肝復發有極大的相關性，而cccDNA的檢測需要對患者肝臟進行穿刺取樣，侵入性檢查會對患者造成一定傷害。有研究表明慢性乙肝患者血清中存在pgRNA，pgRNA來源于非整合的完整的HBV基因組，以衣殼化HBV pgRNA病毒顆粒形式進入血液中，pgRNA能夠反映肝臟內cccDNA的轉錄活動狀態，在HBeAg陽性HBV感染者中，血清pgRNA與肝內cccDNA的水平呈正相關，所以pgRNA可以作為HBV病毒復制和預后的敏感性血清標志物，HBV pgRNA持續陰性和低HBsAg水平可以判定為慢性乙型肝炎的“準臨床治愈”，在指導乙肝治療安全停藥方面具有重要意義。但目前市場上用于檢測pgRNA的技術和試劑盒較少，且pgRNA的檢測易受到來自DNA的干擾，已有產品的靈敏度不能滿足實際需求。雖然申請號為201611099305.8的中國發明專利，公開了一種組合物、其應用以及含有該組合物的試劑盒，其能夠對血液中的HBV pgRNA定量檢測，且靈敏度可低至5個拷貝，但是其檢測是基于數字PCR技術，而基于熒光定量PCR檢測技術的試劑盒還無法達到上述靈敏度。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺陷，本發明所要解決的技術問題是：提供一種利用熒光定量PCR檢測技術的高靈敏度HBV pgRNA檢測試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種檢測血液中HBV pgRNA的試劑盒，包括擴增試劑，所述擴增試劑包括PCR反應液Ⅰ，所述PCR反應液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探針(見表1)。

表1

本發明的有益效果在于：本發明提供的試劑盒，利用RNA單鏈需逆轉錄的特點，在逆轉錄引物的5’端增加一段特異的非HBV的序列，同時將合成該段序列的寡核苷酸作為cDNA擴增的引物，達到特異性擴增pgRNA的目的，使得檢測過程中不受DNA干擾，有效提高了試劑盒檢測時的靈敏度，對乙肝病毒pgRNA的檢測下限(最低檢出限)可達10copies/ml。

附圖說明