[發(fā)明專利]一種用于檢測腫瘤組織C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的方法及試劑盒

在審

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111020016A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 戴方平
• 申請（專利權）人: 江蘇中方基因生物醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權代理有限公司 32243
• 代理人: 陳斐

本發(fā)明涉及分子生物技術領域，公開了一種用于檢測腫瘤組織C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的方法及其從腫瘤組織檢測C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的試劑盒。該方法中C4BPB基因上游引物和下游引物分別位于待擴增靶向異常剪切點的兩端，探針橫跨異常剪切點；C4BPB基因探針5’端修飾有FAM或VIC，3’端修飾有NFQ?MGB。利用本發(fā)明可以檢測C4BPB基因4號和5號外顯子是否發(fā)生內(nèi)含子保留異常剪切事件，操作簡單，靈敏度高，檢測速度快，具有良好的臨床應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物技術領域，具體涉及一種用于檢測腫瘤組織C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的方法及試劑盒。

背景技術

內(nèi)含子保留（IR）是一種選擇性剪接的形式，在哺乳動物系統(tǒng)中早已被人們忽略，盡管在非哺乳動物物種如植物，真菌，昆蟲和病毒中已進行了數(shù)十年的研究。一般認為，錯誤剪接導致內(nèi)含子的保留，除了通過無義介導的衰變而降低基因表達以外，沒有任何生理后果。相對較新的標志性發(fā)現(xiàn)凸顯了IR在正常和與疾病相關的人類生物學中的關鍵作用。通過內(nèi)含子保留剪接的RNA剪接失調(diào)，這在腫瘤轉(zhuǎn)錄組中很常見，它代表了腫瘤新表位的另一個潛在來源，對腫瘤免疫治療具有關鍵指導意義。

C4BPB基因編碼一個蛋白質(zhì)超家族的一個成員，主要由大約60個氨基酸組成的排列一致的短重復序列組成。由該基因編碼的一條獨特的β鏈由七條完全相同的α鏈組裝成C4b結(jié)合蛋白的主要異構(gòu)體，C4b結(jié)合蛋白是一種多聚蛋白，通過經(jīng)典途徑控制補體級聯(lián)的激活。C4b結(jié)合蛋白在凝血系統(tǒng)中也具有調(diào)節(jié)作用，它通過維生素K依賴蛋白S的β鏈結(jié)合，作為活化蛋白C的輔助因子。C4BPB基因與C4和C2激活劑的產(chǎn)生和先天免疫系統(tǒng)有關。

目前臨床上還沒有專門的試劑盒針對基因內(nèi)含子保留異常剪切進行檢測。在之前的各種研究中，基因異常剪切一般都是通過基因測序來檢測，而且需要很好的分析能力才能分析出準確的結(jié)果，價格高、檢測周期長、分析難度大。因此，需要一種人類C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的檢測引物及檢測試劑盒，用于C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種用于檢測腫瘤組織C4BPB基因內(nèi)含子保留異常剪切的方法，所述方法包括以下步驟：步驟1：提取檢測樣本中的RNA,所述樣本需來自新鮮樣本，例如新鮮血液、手術切除/穿刺的腫瘤新鮮樣本/超低溫冷凍樣本/保存在RNA穩(wěn)定液中的樣本；步驟2：將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；步驟3：以cDNA為模板，在異常剪切點靶標區(qū)域分別設計相應引物對和探針，其中C4BPB基因上游引物和下游引物分別位于待擴增靶向異常剪切點的兩端，探針橫跨異常剪切點；步驟4：以步驟2中的cDNA為模板，用步驟3中設計的引物和探針進行實時熒光PCR擴增反應；步驟5：根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷檢測結(jié)果：監(jiān)測反應體系的FAM和VIC熒光強度，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標準，Ct值大于等于38：陰性；，Ct值小于38：陽性。

在一種實施方式中，步驟3中設計C4BPB基因4號外顯子3’端異常剪切的上游引物和下游引物分別位于4號外顯子區(qū)和下游內(nèi)含子區(qū)，探針設計位置橫跨C4BPB基因4號外顯子3’端異常剪切點。

在一種實施方式中，所述C4BPB基因4號外顯子3’端異常剪切的上游引物為SEQ IDNO:1：CCTGTGCTGGTGAATGGAGA，所述C4BPB基因4號外顯子3’端異常剪切的下游引物為SEQID NO:2：ACCTAGTAGGACAGGACCCC，所述C4BPB基因4號外顯子3’端異常剪切的探針為SEQ IDNO:3：AGTAGTAAGTACAAGAGA。

在一種實施方式中，步驟3中設計C4BPB基因5號外顯子5’端異常剪切的上游引物和下游引物分別位于5號外顯子上游內(nèi)含子區(qū)和5號外顯子區(qū)，探針設計位置橫跨C4BPB基因5號外顯子5’端異常剪切點。