[發明專利]一種通過共表達血紅蛋白來提高畢赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇誘導表達量的方法

在審

• 申請號: 201911399666.8
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN110951768A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 刁文濤;李珊珊;陳國參;王雪妍;周伏忠;陳曉飛;馬煥;楊文玲;杜志敏;權淑靜;劉德海;王繼雯;張英濤;解復紅
• 申請（專利權）人: 河南省科學院生物研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/40;C07K14/805;C12P19/14;C12P19/12;C12P19/02;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種通過共表達血紅蛋白來提高畢赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇誘導表達量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）、構建表達質粒pPIC9K- Gal1：用DNA限制性內切酶EcoRⅠ/NotⅠ對α-半乳糖苷酶基因Gal1和畢赤酵母甲醇誘導型表達載體pPIC9K同時進行雙酶切，之后用T4 DNA連接酶將α-半乳糖苷酶基因連接進載體pPIC9K中，形成表達質粒pPIC9K- Gal1；

所述α-半乳糖苷酶基因為在密碼子、mRNA二級結構和GC含量方面進行優化后的米根毛霉（Rhizomucor miehei）來源的一個α-半乳糖苷酶基因；

（2）、構建甲醇誘導型表達α-半乳糖苷酶的畢赤酵母工程菌出發菌株：按照Invitrogen公司的酵母轉化方法將質粒pPIC9K- Gal1轉化到畢赤酵母GS115感受態細胞中，涂布在MD平板上，30℃培養4天，用無菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培養5天，挑選陽性克隆作為出發菌株；

所述的質粒pPIC9K- Gal1為經DNA限制性內切酶PmeⅠ酶切過的質粒；

（3）、構建共表達質粒pPICZαA-PVT- Gal1：以與步驟（1）同樣的方法構建畢赤酵母表達質粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性內切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及畢赤酵母表達質粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA連接酶將PVT連接進表達質粒pPICZαA- Gal1中，形成共表達質粒pPICZαA-PVT- Gal1；

所述基因片段PVT為將透明顫菌血紅蛋白基因vgb置于樹干畢赤酵母低氧誘導啟動子PsADH2及終止子之間形成的DNA片段；

（4）、構建共表達畢赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母轉化方法，將第（2）步得到的出發菌株制作成感受態細胞，將共表達質粒pPICZαA-PVT- Gal1電轉化至其中，涂布在含100 μg/mL博來霉素 的YPDS平板上篩選陽性克隆，得到共表達畢赤酵母工程菌株；

所述共表達質粒pPICZαA-PVT- Gal1為經DNA限制性內切酶PmeⅠ酶切后的質粒。