[發(fā)明專利]一種CD27人源化小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201911396010.0 | 申請日： | 2019-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN111019972A | 公開（公告）日： | 2020-04-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 琚存祥;趙靜;吳丹;張明坤;王鼎玉;侯歡歡;高翔 | 申請（專利權(quán)）人： | 江蘇集萃藥康生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/90;C07K19/00;A01K67/027;A61K49/00 |
| 代理公司： | 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421 | 代理人： | 解敬文;施艷榮 |
| 地址： | 210032 江蘇省南京*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 cd27 人源化 小鼠 模型 構(gòu)建 方法 及其 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明提供了一種制備CD27基因人源化動物的方法，該方法通過同源重組將動物來源的CD27基因編碼的胞外替換為人源CD27基因編碼的胞外區(qū)，保留動物來源CD27基因的胞內(nèi)區(qū)，該方法成功構(gòu)建了人源化CD27動物模型，該模型能夠用于CD27靶向藥物或評價CD27靶向藥物和其他藥物聯(lián)用的療效評價。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動物基因工程和基因遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說，涉及基于基因編輯技術(shù)的CD27基因修飾人源化動物模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)
在近幾十年里，腫瘤免疫療法的發(fā)展，特別是免疫檢查點分子的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，顛覆了傳統(tǒng)腫瘤治療。免疫檢查點分子是一類表達在免疫細胞表面，可以激活或抑制免疫細胞的功能。利用免疫檢測點治療腫瘤就是通過抗體刺激或抑制免疫檢查點蛋白的信號傳導(dǎo)，最終是激活免疫細胞對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)。其中抑制性分子細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)和程序性細胞死亡受體1(PD-1)是目前研究最多的兩個免疫檢查點分子。在此基礎(chǔ)上，又挖掘出更多新的免疫檢查點分子進入臨床試驗階段，包括CD27、CD40、OX40、TIM3、GITR、ICOS等，都成為腫瘤免疫藥物研究的標靶。
CD27是TNF受體超家族中的一員，主要表達在T細胞、B細胞及NK細胞表面。當CD27與它的配體CD70結(jié)合后，可活化T、B細胞并促進其增殖，也可增強NK細胞的活化和功能。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，CD27激活型抗體能夠有效激活免疫細胞對淋巴癌和B16黑色素瘤的抗腫瘤免疫效應(yīng)，為腫瘤免疫療法提供了新靶點。目前已有2個抗體進入臨床階段，分別抗體藥Cusatuzumab和Varlilumab。
免疫檢查點藥物的篩選及臨床前試驗需要在動物模型上進行評價，嚙齒類動物作為應(yīng)用最廣泛的實驗小動物模型，已成為人類腫瘤治療研究中不可或缺的替代模型。但由于種屬性的差異，在小鼠上篩選的免疫檢查點抗體并不完全試用于人類。
為了解決該問題，我們通過基因修飾的方法，將人類的編碼基因替換小鼠相應(yīng)的基因，制備的免疫檢查點人源化小鼠模型，具有人類的功能性基因，可用來篩選評價人類的免疫檢查點藥物。CD27人源化小鼠是指利用基因修飾的方法，在免疫系統(tǒng)健全的小鼠上，將鼠源CD27的胞外區(qū)編碼基因替換為人源CD27胞外區(qū)編碼基因，構(gòu)建能與抗人源CD27抗體相互作用又對內(nèi)部信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不會產(chǎn)生影響的小鼠模型。該模型與普通小鼠相比，實現(xiàn)了關(guān)鍵靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系統(tǒng)，可用于篩選和評價針對人類基因的藥物，是非常理想的臨床前藥物測試模型。同時我們將自主研發(fā)的PD1人源化小鼠與CD27人源化小鼠配繁，獲得PD1與CD27均人源化小鼠模型，能夠用于評價人類PD1抗體，CD27抗體以及兩者聯(lián)合使用的腫瘤抑制效果及藥物的安全性評價，為臨床實驗提供更有效的用藥策略。
在CD27人源化小鼠的過程中，我們對于基因編輯技術(shù)中用到的各個原件和步驟包括人源化區(qū)域的選擇、同源重組過程中的同源臂的設(shè)計、打靶載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、陽新克隆篩選、囊胚注射、受體移植等各項都進行了優(yōu)化和調(diào)整，保證了采用該技術(shù)制備CD27人源化動物模型的高成功率和高準確率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備CD27基因人源化動物的方法，其特征在于，包括將動物來源的CD27基因編碼的胞外替換為人源CD27基因編碼的胞外區(qū)，保留動物來源CD27基因的胞內(nèi)區(qū)，所述人源CD27基因編碼的胞外區(qū)氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
優(yōu)選地，利用同源重組將人源CD27基因編碼的胞外區(qū)替換動物源CD27基因編碼的胞外區(qū)，打靶成功的CD27嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
優(yōu)選地，該方法具體包括如下步驟：
1)打靶載體的構(gòu)建：利用同源重組原理進行打靶載體設(shè)計，所述打靶載體包含a)與待改變的動物源基因區(qū)5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，b)插入的人源DNA序列；和c)與待改變的動物源基因區(qū)3’端同源的第二個DNA片段，即3’同源臂；
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