[發明專利]血清型單核增生李斯特菌特異性新分子靶標及其快速檢測方法

有效

• 申請號: 201911395079.1
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN111118182B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 吳清平;李凡;葉青華;陳謀通;張菊梅;丁郁;吳詩;李瀅;古其會;吳慧清
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心);廣東環凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;王蘭蘭

發明提供了一組用于鑒別常見血清型單核增生李斯特菌特異性新分子檢測靶標，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示。所述靶標能鑒別不同型別的單核增生李斯特菌，例如譜系型Ⅰ、譜系型Ⅱ、譜系型Ⅲ、血清組Ⅰ.1、血清組Ⅰ.2、血清組Ⅱ.1、血清組Ⅱ.2、血清型4a、血清型4c。本發明還提供常見血清型單核增生李斯特菌的檢測方法，該方法針對所述13個特異靶標分子設計特異性引物，對PCR擴增產物進行電泳，通過電泳結果直接判定檢測樣本中是否含有常見的血清型單核增生李斯特菌。

技術領域

本發明屬于微生物檢驗技術領域，涉及鑒別常見血清型單核增生李斯特菌新特異性分子靶標。

背景技術

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種重要的食源性致病菌，WHO將其列為四大食源性病原菌之一，該菌可引起嚴重的李斯特菌病，如腦膜炎、敗血癥、心內膜炎、膿腫和局部的膿性損傷等，敏感人群主要有孕婦、嬰兒、老人和免疫力低下的人群，致死率為20％-30％。據美國CDC數據顯示，每年因李斯特菌引起的疾病約有1600例，死亡約260例(https://www.cdc.gov/listeria/)。我國部分城市有報道偶發李斯特菌病病例，主要人群為孕婦、新生兒等，對我國居民的身心健康造成一定的威脅。作為重要的食源性致病菌，如何鑒定和防控單核細胞增生李斯特菌污染食品是降低單核細胞增生李斯特菌感染的關鍵之一。

單核細胞增生李斯特菌遺傳多樣性豐富，具有13種血清型，分別為1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4ab、4d、4e和7型。根據分子特征和進化關系，又可將單核細胞增生李斯特菌分為四個進化家族，譜系型Ⅰ包括1/2a、1/2c、3a、3c，主要分布于食品和自然環境中；譜系型Ⅱ包括1/2b、3b、4b、4d、4e、4ab和7型，可引起人類李斯特菌病的散發和暴發；譜系型Ⅲ和Ⅳ包括4a、4c和部分4b非典型菌株，主要來自動物李斯特菌病和動物食品。單核細胞增生李斯特菌菌株致病力強弱與血清型直接相關，其中1/2a、1/2b和4b血清型是引起人類李斯特菌病的主要血清型。血清玻片凝集法是單核增生李斯特菌血清分型的“金標準”，但存在不足之處，如診斷血清質量要求高，成本昂貴，且如果血清凝集反應遲緩或特異性差，將造成錯誤的判斷結果。以PCR為主的分子生物學檢測方法以其快速、準確、簡便的特點，逐漸成為取代傳統血清分型方法最具潛力的檢測技術之一。

目前國內外PCR檢測方法大部分是對單核增生李斯特菌進行檢測，針對血清型的PCR檢測靶標及引物的研究報道僅有單核增生李斯特菌譜系型Ⅰ特異性基因lmo0737；單核增生李斯特菌譜系型Ⅱ特異性基因ORF2819；單核增生李斯特菌血清組Ⅰ.2特異性基因lmo1118；單核增生李斯特菌血清組Ⅱ.2特異性基因ORF2110；單核增生李斯特菌血清型1/2a特異性基因LMOSLCC5850_0077、LMOSLCC5850_0078、hsdS。而針對其他譜系型、血清組和血清型的PCR檢測靶標及引物的研究報道幾乎沒有，因此，也沒有有關其他譜系型、血清組和血清型檢測的PCR方法建立的報道。

經對現有技術的檢索，尚未發現與本發明的13個單核增生李斯特菌常見血清型特異性新分子靶標及相應的PCR檢測方法報道。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供用于鑒別常見血清型單核增生李斯特菌，即單核增生李斯特菌譜系型Ⅰ(1/2a-3a-1/2c-3c)、譜系型Ⅱ(1/2b-3b-7-4b-4d-4e-4ab)、譜系型Ⅲ(4a-4c)、血清組I.1(1/2a-3a)、血清組Ⅰ.2(1/2c-3c)、血清組Ⅱ.1(4b-4d-4e-4ab)、血清組Ⅱ.2(1/2b-3b-7)、血清型4a、血清型4c的特異性新分子靶標及相應的PCR檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案來實現：

一組用于檢測血清型單核增生李斯特菌的分子靶標，所述分子靶標包括如SEQ IDNO.1～13所示的核苷酸序列。