[發(fā)明專利]一種平衡玻璃化冷凍試劑及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911393090.4
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN112056305B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 裘娟;張雪男
• 申請（專利權(quán)）人: 裘娟
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發(fā)明涉及生殖冷凍領(lǐng)域，特別涉及一種平衡玻璃化冷凍試劑及其應(yīng)用。平衡玻璃化冷凍試劑按體積百分比計：乙二醇(EG)8?15％、二甲基亞砜(DMSO)8?15％、聚蔗糖?蔗糖?磷酸鹽緩沖液(FS)70?84％。由于本發(fā)明采用了低濃度的滲透性保護(hù)劑配方，減少了對胚胎的毒性作用，同時減少了試劑的粘性，使操作更容易，胚胎在本發(fā)明的平衡玻璃化冷凍試劑中處于平衡玻璃化狀態(tài)，胚胎可以在干冰(?78℃)的條件下存放或運(yùn)輸而不發(fā)生細(xì)胞內(nèi)冰晶形成損傷細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生殖冷凍領(lǐng)域，特別涉及一種平衡玻璃化冷凍試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來我國的不孕不育率上漲幅度加快，隨著環(huán)境污染、生育年齡推遲、生活壓力等原因，不孕夫婦人數(shù)還在增加。隨著輔助生殖技術(shù)的開展，胚胎冷凍技術(shù)在每個生殖中心得到廣泛的應(yīng)用，由于女方經(jīng)歷了控制性超促排卵，有可能得到多個卵子以及多枚胚胎。大多數(shù)患者選擇將本次周期不需要的胚胎進(jìn)行冷凍保存，一旦該周期未妊娠或者后期想要二胎，解凍胚胎進(jìn)行自然周期的胚胎移植技術(shù)可以得到同樣高的妊娠機(jī)會。

胚胎凍存是輔助生殖技術(shù)的重要組成部分,一方面對于減少多胎妊娠,避免浪費(fèi)胚胎資源具有重要意義；另一方面,胚胎凍存技術(shù)對高效率、低成本保存動物種系、人類遺傳疾病資源的動物模型、建立胚胎銀行等都具有重要意義。因此，胚胎冷凍技術(shù)在每個生殖中心胚胎實驗室中作為一項重要的技術(shù)，其保護(hù)劑的選擇、冷凍及解凍方法的操作、凍融胚胎的發(fā)育潛能及著床率，均成為專家學(xué)者的討論焦點(diǎn)，其重要性備受關(guān)注。

冷凍復(fù)蘇技術(shù)迅速發(fā)展，尤其是操作簡單、耗時短的玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用使冷凍胚胎的存活率明顯提高。盡管冷凍復(fù)蘇技術(shù)日趨成熟，但冷凍或復(fù)蘇操作過程仍有可能會對部分胚胎造成損傷。因此，對胚胎冷凍技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化及質(zhì)量控制十分必要。

目前冷凍胚胎的方法主要有平衡慢速冷凍技術(shù)、不平衡玻璃化冷凍技術(shù)以及平衡玻璃化冷凍技術(shù)。

平衡慢速冷凍技術(shù)是在10年前普遍應(yīng)用的方法，其需要程序化冷凍儀在冷凍過程中需要技術(shù)員進(jìn)行“植冰”的操作，整個過程持續(xù)3小時，漫長又費(fèi)人力，這個方法目前已經(jīng)被不平衡玻璃化冷凍技術(shù)替代。

不平衡玻璃化冷凍技術(shù)是通過高濃度冷凍試劑滲透胚胎，然后快速投入液氮(-196℃)中形成無結(jié)構(gòu)的玻璃樣物質(zhì)，從而避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，保護(hù)胚胎免受機(jī)械性損傷。因此目前絕大多數(shù)生殖中心采用不平衡玻璃化技術(shù)冷凍胚胎。但是其缺點(diǎn)是(1)只能存放于液氮中，溫度高于-130℃就會發(fā)生去玻璃化，從而產(chǎn)生對胚胎致命的細(xì)胞內(nèi)冰晶。這就給運(yùn)輸冷凍胚胎帶來了不方便，液氮無法上飛機(jī)，也不能密封，運(yùn)輸過程需要大量的液氮補(bǔ)給。(2)玻璃化冷凍法為達(dá)到玻璃化狀態(tài)，必須用極少的液體承載胚胎，使胚胎降溫速度達(dá)到10000℃/min，所以都采用開放式載桿或尼龍圈讓裝胚胎的液滴直接接觸液氮達(dá)到高速降溫，而液氮是由公司制作配送，其生物安全有待考量。有報道關(guān)于液氮交叉污染帶來了潛在生物傷害問題，這方面問題仍未得到徹底解決。(3)為了確保達(dá)到玻璃化狀態(tài)，玻璃化冷凍試劑大多使用30％(v/v)或者更高的滲透性保護(hù)劑，這樣可以在短時間使細(xì)胞內(nèi)滲入更多的冷凍試劑，殘留更少的水分子。從而使胚胎在冷凍過程中承受了更大的滲透壓和滲透性冷凍試劑的化學(xué)毒性及對胚胎表觀遺傳產(chǎn)生影響，敏感的卵子用玻璃化方法的發(fā)育率就很低，可以看出玻璃化冷凍劑對細(xì)胞代謝是有影響的。

隨著植入前胚胎遺傳學(xué)診斷技術(shù)(PGT)日益成熟，其應(yīng)用越來越廣泛，截止2018年12月經(jīng)批準(zhǔn)開展人類輔助生殖技術(shù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)有498家，而開展PGT的醫(yī)療機(jī)構(gòu)只有53家。所以很多生殖中心沒有胚胎活檢技術(shù)，患者如果要做胚胎活檢，必須從能夠有胚胎活檢和PGT的生殖中心就診，這無疑增加了患者的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和大中心的業(yè)務(wù)負(fù)擔(dān)。如果患者能夠就近在生殖中心冷凍胚胎，再使用方便攜帶運(yùn)輸?shù)姆绞竭\(yùn)輸?shù)接蠵GT資質(zhì)的中心胚胎解凍及活檢，將更方便患者及醫(yī)療資源的平均分配。但是現(xiàn)階段大多數(shù)生殖中心使用不平衡玻璃化冷凍技術(shù)冷凍胚胎，其特點(diǎn)是冷凍胚胎不能離開液氮，因而也無法攜帶運(yùn)輸。