[發(fā)明專利]一種酮還原酶及其在(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911392942.8
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN111041010B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁雪峰;李佳松
• 申請（專利權(quán)）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/70;C12P7/62
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32509
• 代理人: 胡麗華

本發(fā)明公開了一種酮還原酶及其在(R)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該酮還原酶源于Meyerozyma guilliermondii，可用于轉(zhuǎn)化4?氯乙酰乙酸乙酯生成(R)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯，該酮還原酶，其序列為SEQ ID NO.8，其來源是大腸桿菌重組表達(dá)，該酮還原酶的表達(dá)質(zhì)粒的密碼子已經(jīng)為在宿主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的表達(dá)質(zhì)粒的密碼子，該酮還原酶將4?氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成(R)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯，其使用異丙醇或葡萄糖用于輔酶NAD再生為NADH。本發(fā)明酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強(qiáng)2?10倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酮還原酶及其應(yīng)用，特別是涉及一種酮還原酶及其在(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

酮還原酶是一種多用途催化劑，通過醛或酮的對映體選擇性還原成對應(yīng)醇。(R)特異性酮還原酶與(S)特異性酮還原酶具有不同特性，并且這些催化劑在光學(xué)活性醇的工業(yè)合成中被越來越頻繁地用到。旋光性是許多醫(yī)藥和農(nóng)藥活性化合物選擇性作用的必要條件，在一些情況下，一個(gè)對映體具有有益的藥物活性，另一個(gè)對映體卻具有基因毒性作用。因此，在藥用和農(nóng)藥用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立體特異性的催化劑合成光學(xué)活性醇。

手性純的(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯是一種重要的手性醇。(R)-CHBE(4-氯-3-羥基丁酸乙酯)已經(jīng)被用作(R)-肉堿，R-4-氨基-3-羥基丁酸，(R)-4-羥基-2-吡咯烷酮和其他五烯化學(xué)品的主要前體。并且近年來有報(bào)道將(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯用于超級他汀類藥物的新合成路線，有望打破原合成工藝的專利壟斷。一些屬于SDRs的氧化還原酶已被篩選并應(yīng)用于生物還原4-氯乙酰乙酸乙酯為CHBE(4-氯-3-羥基丁酸乙酯)。大多數(shù)報(bào)道的微生物酶產(chǎn)生的都是(S)型CHBE，并同時(shí)具有高對映選擇性和高產(chǎn)率。但是，僅有極少有酶能產(chǎn)生(R)型CHBE，并伴隨立體選擇性較低(如70％e.e.)或產(chǎn)率低等特性。許等人報(bào)道了一株產(chǎn)酮的芽孢桿菌還原酶，其中一個(gè)羰基還原酶能轉(zhuǎn)化COBE為(R)-CHBE(99.6％e.e.)，收率為91.7％，但是需要用到水-甲苯兩相系統(tǒng)，底物需要分三次加入反應(yīng)體系，增加了生產(chǎn)成本并加重了生產(chǎn)負(fù)擔(dān)；并且該催化體系活力偏低，需要依賴投入大量的酶或細(xì)胞才能使反應(yīng)結(jié)束(0.5g干細(xì)胞催化2.158g底物)，對于市場需用量大價(jià)格低廉的中間體CHBE來說該工藝幾乎不具有放大前景。

日本人Kataoka等使用Sporobolomyces salmonicolor來源的酮還原酶被用來做(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，底物濃度高達(dá)300gL，但是只有92％的手性純度，無法應(yīng)用于對手性純度高要求的藥物合成。

中國專利CN104988085A利用(R)4-氯-3-羥基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方法，以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)及其衍生物為起始原料，利用重組E.coli CCZU-H15靜息細(xì)胞為生物催化劑，以葡萄糖為輔底物，實(shí)現(xiàn)了(R)-CHBE及其衍生物的合成。

中國專利CN103160547中利用Candida albicans來源的醇脫氫酶不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯，以醇脫氫酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，不對稱還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。但是底物濃度僅為25g/L-50g/L，且投酶量過高(5g菌體/25ml體系)，轉(zhuǎn)化率低，不具備工業(yè)生產(chǎn)前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是為了提供一種酮還原酶及其在(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過采用如下技術(shù)方案達(dá)到：

一種酮還原酶，其源于Meyerozyma guilliermondii，可用于轉(zhuǎn)化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，該酮還原酶，其序列為SEQ ID NO.8。

一種酮還原酶，該酮還原酶的來源是大腸桿菌重組表達(dá)。