[發明專利]一種基于超薄光纖微流激光器的高靈敏度免疫分析裝置及方法

在審

• 申請號: 201911392324.3
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN111044733A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 龔朝陽;楊熙;龔元;饒云江
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/31
• 代理公司: 電子科技大學專利中心 51203
• 代理人: 陳一鑫

1.一種基于超薄光纖微流激光器的高靈敏度免疫分析裝置，該裝置包括脈沖激光器(1)、衰減片(2)、分束器(3)、脈沖能量計(4)、柱面透鏡(5)、超薄光纖微流激光器(6)、收集透鏡(7)、收集光纖(8)、光譜分析儀(9)、位移臺；光纖軸向的位移通過位移臺精確控制；脈沖激光器出射的激光經過衰減片衰減，經分束器分束后，一路入射到脈沖能量計上用于實現脈沖能量的實時檢測，另一路經柱面透鏡匯聚成線狀光斑，垂直照射于超薄光纖微流激光器表面；收集透鏡位于超薄光纖微流激光器正上方，用于將出射的激光信號耦合入收集光纖；收集光纖連接收集透鏡和光譜分析儀，將激光信號送入光譜分析儀進行分析；

所述超薄光纖微流激光器通過在單模光纖表面交聯捕獲抗體和streptavidin-cy3分子實現；通過光纖表面的捕獲抗體捕獲溶液中的待測抗原，并使光纖表面的streptavidin-cy3分子數目與抗原濃度正相關；光纖表面交聯的streptavidin-cy3分子作為光纖微流激光器的增益介質；光纖表面支持回音壁模式，為激光輸出提供光反饋；

所述超薄光纖微流激光器使用單模光纖作為諧振腔，捕獲抗體固相于光纖表面實現對抗原的檢測，固相于光纖表面的亞分子層量級厚度的streptavidin-cy3分子薄膜為增益介質；光纖表面總的streptavidin-cy3分子數一部分直接固相于光纖表面，為超薄光纖微流激光器提供預偏置使之滿足激光閾值條件，另一部分來自于捕獲抗體結合抗原，通過cy3標記的檢測抗體固相于光纖表面；光纖總的streptavidin-cy3分子數影響最終激光輸出強度并與抗原濃度正相關。因此，通過測量超薄光纖微流激光器輸出激光強度可實現抗原濃度的檢測。

2.如權利要求1所述的一種基于超薄光纖微流激光器的高靈敏度免疫分析裝置，其特征在于所述超薄光纖微流激光器的光纖尺寸為80μm-150μm。

3.采用權利要求1所述的基于超薄光纖微流激光器的高靈敏度免疫分析裝置，對標記物alpha-synuclein的檢測方法為：

步驟1：超薄光纖微流激光器制作；

首先，將光纖在丙酮中浸泡1小時后剝除，并使用新鮮H2SO4/H2O2＝7:3,v/v溶液處理12個小時；然后，使用去離子水清洗光纖3次，每次5分鐘，再用丙酮浸泡光纖20分鐘，并使光纖在空氣中干燥；其次，用濃度為5％的APTES丙酮溶液浸泡光纖6小時，并使用丙酮、乙醇、PBS依次分別清洗光纖10分鐘；接著，使用濃度為25μM的NHS-biotion溶液浸泡光纖30分鐘，之后使用清洗緩沖液清洗20分鐘，用PBS清洗2次，每次10分鐘；再次，使用濃度為50mg/mL的DSS溶液浸泡光纖2小時，之后使用DMSO清洗10分鐘；接下來，使用濃度為120μg/mL的捕獲抗體浸泡2小時，之后使用清洗緩沖液清洗3次，每次5分鐘；最后，將光纖在濃度為100μg/mL的streptavidin-cy3溶液中分別孵育40分鐘，之后使用清洗緩沖液清洗10分鐘；

步驟2：抗原孵育；

使用不同濃度的alpha-synuclein溶液分別浸泡超薄光纖微流激光器1小時，隨后使用清洗緩沖液清洗10分鐘；

步驟3：檢測抗體孵育；

使用濃度為1.5μg/mL的檢測抗體溶液分別浸泡步驟2得到的不同濃度下各超薄光纖微流激光器1小時，隨后使用清洗緩沖液清洗10分鐘；

步驟4：再次在streptavidin-cy3中孵育；

將各超薄光纖微流激光器在濃度為100μg/mL的streptavidin-cy3溶液中孵育40分鐘，將超薄光纖微流激光器浸入檢測抗體溶液中靜止孵育40分鐘，隨后使用清洗緩存液清洗10分鐘；

步驟5：打開脈沖激光器，調節衰減片大小，使得泵浦能量為1.4mJ；

步驟6：分別測量驟4得到的經過不同濃度的alpha-synuclein溶液處理過的超薄光纖微流激光器激光輸出信號；

首先使用光譜分析儀記錄單個脈沖泵浦激光作用下超薄光纖激光器某一軸向位置的輸出光譜，然后將超薄光纖微流激光器沿著軸向移動250μm；每個超薄光纖微流激光器采集30-40個不同位置的激光輸出光譜；

步驟7：分別計算經不同濃度alpha-synuclein溶液處理過的超薄光纖微流激光器輸出的對數光譜積分強度并繪制標定曲線；

定義對數光譜積分強度其中[A,B]為激光輸出的光譜范圍，Iⁱ(λ)為第i次測量的輸出光譜；隨后計算對數積分強度均值并繪制對數積分強度均值-濃度的關系曲線；

步驟8：采用步驟1到步驟7相同的方法得到待檢測alpha-synuclein溶液的標定曲線，匹配出下最相似的標定曲線，對應的濃度為待檢測alpha-synuclein溶液的濃度。

4.如權利要求3所述的標記物alpha-synuclein的檢測方法，其特征在于所述步驟2中不容濃度為0pM、0.14pM、0.42pM、1.4pM、4.2pM和14pM。