[發(fā)明專利]玉米紋枯病抗病相關(guān)基因ZmPR1a的應(yīng)用和篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911388892.6
• 申請日: 2019-12-30
• 公開（公告）號: CN110982926B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳斌;趙福成;韓海亮;侯俊峰;王桂躍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省東陽玉米研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/29
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 張金剛

1.一種玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a.玉米苗期接種紋枯病菌；

b.取樣進(jìn)行RNA提取；

c.cDNA合成；

d.熒光定量PCR檢測ZmPR1a基因的相對表達(dá)量；

e.對ZmPR1a基因的相對表達(dá)量隨接種時(shí)間的變化篩選玉米品種抗病性；

所述熒光定量PCR的20μl反應(yīng)體系為：2?×?ChamQ?Universal?SYBR?qPCR?Master?Mix10?μl，Primer?F?0.4?μl，Primer?R?0.4?μl，Template?cDNA?1?μl，ddH₂O?8.2?μl；其中，

Actin的Primer?F：GGTTCTATTCCAGCCATCCTTCATTG，

Actin的Primer?R：TCTCCTTGCTCATGCGGTCAC，

ZmPR1a的Primer?F：GGCGAGAGCCCCTACTAGAC

ZmPR1a的Primer?R：?AAATCGCCTGCATGGTTTTA；

步驟e中ZmPR1a基因的相對表達(dá)量隨接種時(shí)間的變化篩選玉米品種抗病性為：接種時(shí)間玉米苗期接種紋枯病菌后n小時(shí)時(shí)，ZmPR1a基因的相對表達(dá)量為C_n，在0＜n≤24內(nèi)，至少有一次C_n≥4，且C_n均不低于C₀的玉米品種為玉米紋枯病抗性品種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，n等于6、12和/或24。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，相對表達(dá)量Cn通過△△CT方法計(jì)算得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，步驟a中所述玉米苗期接種紋枯病菌為將帶玉米紋枯病菌的高粱粒放置于三葉期玉米苗的第一葉鞘中，于室溫培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，步驟b為取接種部位上下各1?cm的植物組織，用液氮速凍再研磨成粉末，取50-100?mg加1?ml?Trizol，室溫靜置；加200?μl預(yù)冷的氯仿，劇烈震蕩15?s，室溫靜置10-15?min；12000?g，4℃離心5?min；取上層水相轉(zhuǎn)入1.5?ml離心管中，加500?μl異丙醇，置于-20℃充分沉淀1?h；12000?g，4℃離心10?min，小心移去上清，防止吸走沉淀；75%乙醇洗兩遍，7500?g，4℃離心5?min；空管離心2?min；小心吸去上清，倒置干燥2?min；加30?μl?DEPC-H₂O溶解，測定RNA濃度。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法，其特征在于，步驟c為將提取的RNA每1?μg加入4?×?gDNA?wiper?Mix?4?μl，用RNase-free?ddH₂O補(bǔ)齊至16?μl，混勻，42℃反應(yīng)2?min；再直接加入5?×?HiScript?III?qRT?SuperMix?4?μl，混勻，37℃反應(yīng)15min，85℃變性5?sec，產(chǎn)物待用。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米紋枯病抗性的快速篩選方法所用到基因的應(yīng)用，其特征在于，ZmPR1a在快速篩選玉米紋枯病抗性中的應(yīng)用。