[發(fā)明專利]一種溶菌酶親和填料制備及應(yīng)用方法

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• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN113046343A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單玉飛;曹飛婷;方利
• 申請（專利權(quán)）人: 常州天地人和生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N11/10;C12N11/14;C12N11/089;C07K16/40;C07K1/22
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1.一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：通過與固相載體表面的羥基、羧基、氨基或環(huán)氧基鍵合，將溶菌酶固定在固相載體上即得溶菌酶親和填料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：溶菌酶親和填料的具體制備步驟如下；

（1）填料活化：將固相載體溶液的PH調(diào)至13~14，加入活化劑和還原劑進行反應(yīng)，結(jié)束后用去離子水清洗；

（2）配體偶聯(lián)：向步驟（1）反應(yīng)后的體系中加入溶菌酶和無游離氨基的偶聯(lián)緩沖液，調(diào)節(jié)其pH為8~10后進行反應(yīng)，結(jié)束后用去離子水清洗；

（3）封閉反應(yīng)：向步驟（2）反應(yīng)后的體系中加入封閉劑，調(diào)節(jié)其pH為8~9后進行反應(yīng)，結(jié)束后用去離子水清洗，即得溶菌酶親和填料。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，所述活化劑為環(huán)氧氯丙烷，所述還原劑為硼氫化鈉溶液，反應(yīng)溫度為20~40℃，反應(yīng)時間為2~6h；步驟（2）中，所述無游離氨基的偶聯(lián)緩沖液為碳酸鹽或磷酸鹽，反應(yīng)溫度為20~50℃，反應(yīng)時間為8~24h；步驟（3）中，反應(yīng)溫度為25~40℃，反應(yīng)時間為1~2h，所述封閉劑為乙醇胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：溶菌酶親和填料的具體制備步驟如下；

（1）將活化后的固相載體用HCl溶液抽濾清洗后，用偶聯(lián)液清洗；

（2）將溶菌酶溶解加入步驟（1）清洗后的固相載體中反應(yīng)；

（3）去離子水清洗步驟（2）得到的填料，加入封閉液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，去除封閉液，清洗，即得溶菌酶抗體親和填料。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，所述偶聯(lián)液為pH8的0.2M NaHCO₃和0.5M NaCl的混合溶液；步驟（2）中，固相載體與的溶菌酶體積比為1：（1~2），反應(yīng)條件為25~30℃下振蕩反應(yīng)2~4h或4~6℃反應(yīng)過夜。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種溶菌酶親和填料的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，反應(yīng)條件為25~30℃下振蕩反應(yīng)1~2h；去除封閉液后的清洗方法為：先用2~3倍柱體積的去離子水清洗填料，再用pH4的0.1M乙酸-乙酸鈉和0.5M NaCl的混合溶液清洗1~2次，接著用pH8的0.1M Tris-HC和0.5M NaCl的混合溶液清洗1~2次，最后用去離子水重復(fù)沖洗2~3次。

7.一種權(quán)利要求1所述的溶菌酶親和填料的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）采用平衡液平衡溶菌酶親和填料；

（2）取溶菌酶抗體粗品溶液，加入步驟（1）中平衡后的溶菌酶親和填料上；

（3）采用0.1M、pH3~4的甘氨酸進行洗脫，即得純化后的溶菌酶抗體純品。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的溶菌酶親和填料的應(yīng)用方法，其特征在于：溶菌酶抗體可由宿主細(xì)胞中重組表達得到。