[發(fā)明專利]治療β-球蛋白功能缺失的重組慢病毒載體及制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911379764.5
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN113046392B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 歐陽文杰;劉超;董國藝;李靜;顧穎;侯勇
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市禾沐基因生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;A61K48/00;A61K31/7088;A61P7/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

1.一種治療β-球蛋白功能缺失的重組慢病毒載體，其特征在于：包括基因元件，所述基因元件由依序連接的左側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列、慢病毒逆響應(yīng)元件、中心多嘌呤序列、β-球蛋白基因的基因座調(diào)控序列、第87位蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０返摩?球蛋白基因和右側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列組成；

所述左側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列的U3區(qū)域被替換為巨細(xì)胞病毒啟動子；

所述β-球蛋白基因的基因座調(diào)控序列為SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8、SEQID?NO.9、SEQ?ID?NO.10或SEQ?ID?NO.11所示序列；

所述右側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列的U3區(qū)被修飾和替換為SV40多聚腺苷酸型號；

所述重組慢病毒載體采用的慢病毒骨架載體為pLenti載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組慢病毒載體，其特征在于：所述β-球蛋白基因的基因座調(diào)控序列為SEQ?ID?NO.7所示序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組慢病毒載體，其特征在于：所述左側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列為SEQ?ID?NO.1所示序列；

所述慢病毒逆響應(yīng)元件為SEQ?ID?NO.2所示序列；

所述中心多嘌呤序列為SEQ?ID?NO.3所示序列；

所述第87位蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０返摩?球蛋白基因?yàn)镾EQ?ID?NO.4所示序列；

所述右側(cè)慢病毒長末端重復(fù)序列為SEQ?ID?NO.5所示序列。

4.一種慢病毒，其特征在于：所述慢病毒中含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組慢病毒載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組慢病毒載體或權(quán)利要求4所述的慢病毒在制備治療β-球蛋白功能缺失的疾病的藥物中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟，

采用慢病毒骨架載體上的多克隆位點(diǎn)中的一對限制性內(nèi)切酶，將慢病毒骨架載體線性化；

采用根據(jù)線性化的慢病毒骨架載體設(shè)計的Gibson組裝引物分別擴(kuò)增β-球蛋白基因的基因座調(diào)控序列和第87位蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０返摩?球蛋白基因；

采用Gibson組裝法將擴(kuò)增的β-球蛋白基因的基因座調(diào)控序列和第87位蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０返摩?球蛋白基因組裝到慢病毒骨架載體，獲得所述重組慢病毒載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述一對限制性內(nèi)切酶為EcoRV和BamHI。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述Gibson組裝引物包括LCR片段Gibson組裝引物對、HBB編碼區(qū)片段1Gibson組裝引物對、HBB編碼區(qū)片段2Gibson組裝引物對；

所述LCR片段Gibson組裝引物對的正向引物為SEQ?ID?NO.12所示序列，反向引物為SEQID?NO.13所示序列；

所述HBB編碼區(qū)片段1Gibson組裝引物對的正向引物為SEQ?ID?NO.14所示序列，反向引物為SEQ?ID?NO.15所示序列；

所述HBB編碼區(qū)片段2Gibson組裝引物對的正向引物為SEQ?ID?NO.16所示序列，反向引物為SEQ?ID?NO.17所示序列。