[發明專利]采用饑餓發酵工藝生產基因治療質粒的方法及發酵培養基

在審

• 申請號: 201911375992.5
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN111057800A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 曾杰;梁焯;曹曦;姚樹元;辛晨浩
• 申請（專利權）人: 無錫生基醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q3/00
• 分類號: C12Q3/00;C12P1/04;C12N15/63;C12R1/19
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

1.一種采用饑餓發酵工藝生產基因治療質粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)發酵罐準備：將一次性pH電極、一次性DO電極和一次性冷卻管路插入到一次性罐體相應位置；發酵培養基配制好后將一次性罐體滅菌；完成發酵罐各管路的連接，設定溫控系統(TCU)的溫度并運行；

(2)參數設置：設置工藝空氣減壓閥壓力0.50bar；設置發酵罐參數：溫度37.0℃、通氣量3.0L/min、轉速200rpm；設置pH7.20±0.02開啟自動控制補堿瓶進行補堿；在移除溶氧電極線時調節DO零點0％，插上電極線，設置最大轉速，調節DO滿度95-100％；

(3)接種：通過接種管路接種，即通過無菌接管機將搖瓶的一次性轉接蓋管路與發酵罐連接，將搖瓶中菌液泵入發酵罐，用并無菌封管機封閉管路；

(4)饑餓發酵控制：將溶氧DO與轉速關聯控制，控制DO≥20％，設置最小轉速為初始轉速，開啟DO自動控制；定義接種時間為0小時，當培養至DO值開始升高時，開始補料，設定補料泵速度0.5％-2％發酵體積/h；當DO值再次開始升高時，提高補料泵速度至1％-4％發酵體積/h；當培養至平臺期時停止補料；待DO上升至40％以上后，繼續饑餓發酵培養20min～2h之后結束發酵。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，發酵罐各管路的連接包括補料管路、補堿管路、接種管路、發酵罐進氣管路、發酵罐排氣管路、冷卻管路的連接。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，各管路連接時，使用無菌接管機及無菌封管機進行連接操作。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，一次性pH電極使用之前先進行電極校準。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述滅菌的條件為121.0℃，20min滅菌。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，溫控系統的溫度設定為4-10℃。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，發酵培養基的配方為：每1L發酵培養基含：大豆蛋白胨10g-20g，酵母粉5g～10g，(NH₄)₂SO₄ 2g～6g，Na₂HPO₄·7H₂O 12g～24g，KH₂PO₄ 2g～4g，甘油15g～30g，MgSO₄ 0.4g～0.8g。所述發酵培養基的配方中還含有適量的消泡劑，約0.3～1g。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為：每1L發酵培養基含：大豆蛋白胨20g，酵母粉10g，(NH₄)₂SO₄ 4g，Na₂HPO₄·7H₂O 17.8g，KH₂PO₄ 3g，甘油25g，MgSO₄ 0.6g。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，初始補料速率為1.2％-1.5％發酵體積/h，然后補料速率提高至2.4％-3％發酵體積/h。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，當發酵培養14h時，停止補料。

11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，停止補料，待DO上升至40％以上后，饑餓發酵培養20min～60min。