[發(fā)明專利]一種軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911374797.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111057677B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁成振;夏楷順;李中偉;李榮輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發(fā)明提供一種軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)基，由DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、脯氨酸、丙酮酸鈉、維生素C、胰島素生長(zhǎng)因子、FGF2、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ROCK抑制劑、p38抑制劑和GSK?3α/β抑制劑組成。通過(guò)混合各組分，再調(diào)節(jié)混合物pH和滲透壓后滅菌處理制得。本發(fā)明為培養(yǎng)細(xì)胞提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定的生存環(huán)境，使其具有優(yōu)異的自我更新能力。因未使用動(dòng)物源成分，有效規(guī)避因此而造成污染的發(fā)生，完全避免誘發(fā)免疫反應(yīng)的發(fā)生。培養(yǎng)基制備方法步驟簡(jiǎn)單、原料易得，不含血清，可保持CPCs的未分化、多能狀態(tài)，專用于軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增。本發(fā)明是一個(gè)長(zhǎng)久持續(xù)高效的CPCs培養(yǎng)系統(tǒng)，使體外穩(wěn)定繁殖功能性小鼠和人軟骨祖細(xì)胞成為可能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于培養(yǎng)基領(lǐng)域，具體地，涉及一種軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

透明關(guān)節(jié)軟骨作為滑膜關(guān)節(jié)的重要組成部分，具有維持骨骼的靈活性和關(guān)節(jié)的平滑性的功能。成年后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為軟骨細(xì)胞的一個(gè)亞群，緩慢維持著軟骨組織的穩(wěn)定。肥大軟骨細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不同，其存在于生長(zhǎng)板中，其功能是骨形成過(guò)程中產(chǎn)生新的軟骨。為了治療退行性關(guān)節(jié)疾病，用體外產(chǎn)生的細(xì)胞或組織替代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或關(guān)節(jié)軟骨為目前的主要治療選擇——全關(guān)節(jié)置換提供了一個(gè)全新的可選方案。而對(duì)于不同的細(xì)胞治療而言，確保干細(xì)胞或祖細(xì)胞的良好來(lái)源是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。迄今為止，針對(duì)退行性關(guān)節(jié)疾病的組織工程解決方案的研究主要集中在成熟的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和多能干細(xì)胞(PSCs)，軟骨祖細(xì)胞(CPC)的相關(guān)研究較少。

PSCs為軟骨細(xì)胞的產(chǎn)生提供了一個(gè)有吸引力的細(xì)胞來(lái)源。胚胎干細(xì)胞(ESCs)已經(jīng)在諸多文獻(xiàn)中證明可以通過(guò)生長(zhǎng)因子的調(diào)控，先向中胚層細(xì)胞分化，進(jìn)而分化為軟骨細(xì)胞分。然而，這些分化方案所產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量非常少需要進(jìn)一步的改良。最新的研究表明，胎兒組織是干細(xì)胞治療的一個(gè)非常有前途的細(xì)胞來(lái)源。我們和其他人已經(jīng)從許多胎兒組織中分離出多種干細(xì)胞群，包括血、肺、肝、腎、腦和臍帶。與成體干細(xì)胞相比，這些胚胎來(lái)源的干細(xì)胞具有更高的增殖潛能和更強(qiáng)的多能性。同時(shí)，它們?cè)谥铝鲂院兔庖邞?yīng)答方面的問(wèn)題也較少。

大量研究表明，許多組織中都包含有大量的干細(xì)胞組織，文獻(xiàn)報(bào)道顯示軟骨組織中也包含有祖細(xì)胞樣細(xì)胞。許多研究小組已經(jīng)在人類、馬和牛的成年關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)鑒定了CPCs。CPCs具有多向分化潛力并且其細(xì)胞表面具有特異性標(biāo)志物(例如CD105,CD166和STRO-1)，但總的來(lái)說(shuō)他們的起源和功能尚需進(jìn)一步證明。

重要的是，由于以下原因，目前分離到的CPCs并不適合用于軟骨退變治療。首先，大多數(shù)研究人員在GA≥8周時(shí)分離出hCPCs，此時(shí)大多數(shù)hCPCs可能已經(jīng)沿著軟骨細(xì)胞譜系進(jìn)展。Quintin等人報(bào)道說(shuō)，在GA 14-16周分離的細(xì)胞可以向軟骨譜系分化，但不能向下分化成骨或脂肪。其次，由于細(xì)胞傳代的限制，不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞用以進(jìn)一步軟骨修復(fù)。因此，必須進(jìn)一步研究獲取能夠促進(jìn)CPCs長(zhǎng)期持久自我更新的培養(yǎng)條件。第三，CPCs在體內(nèi)的成功移植尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)基，所述軟骨祖細(xì)胞培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、脯氨酸、丙酮酸鈉、維生素C、胰島素生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ROCK抑制劑、p38抑制劑和GSK-3α/β抑制劑組成。

上述原料的含量可以在一定的范圍內(nèi)選擇，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了使得細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中能夠具有更為穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，所述DMEM培養(yǎng)基與所述F12培養(yǎng)基的含量的體積比為1：0.5-2；且以實(shí)際所需所述培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述維生素C的濃度為50-200μg/mL，所述胰島素生長(zhǎng)因子的濃度為1-150ng/mL，所述FGF2的濃度為1-150ng/mL，所述GSK-3α/β抑制劑的濃度為1-30uM，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為5-100μg/mL，所述ROCK抑制劑的濃度為1-50uM，所述p38抑制劑的濃度為1-20uM，所述脯氨酸的濃度為0-10mM，所述丙酮酸鈉的濃度為1-15mM。