[發(fā)明專利]一種用于進行病毒包裝效率檢測的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911374412.0
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN111254219B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋凱;張慶華;王世東;請求不公布姓名
• 申請（專利權(quán)）人: 上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京中索知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11640
• 代理人: 隋曉勇

本發(fā)明提供了一種檢測病毒包裝效率的方法，該方法基于病毒成功包裝核酸后表面電荷會發(fā)生變化，通過檢測病毒表面帶電荷的相對情況，判斷成功包裝核酸的病毒顆粒數(shù)量，進而計算病毒顆粒包裝效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型的病毒包裝效率檢測方法，特別是在轉(zhuǎn)基因與基因治療領(lǐng)域中，用于判斷病毒包裝外源基因的包裝效率。

背景技術(shù)

基因治療(gene?therapy)是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病，以達到治療目的。也包括轉(zhuǎn)基因等方面的技術(shù)應(yīng)用。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。相比傳統(tǒng)醫(yī)療手段，以基因技術(shù)為基礎(chǔ)的基因治療手段更具針對性，能夠獲得較為理想的治療效果，并能大大減輕患者痛苦，其應(yīng)用被業(yè)內(nèi)普遍看好。自2012年開始，全球新增基因治療臨床試驗754例。其中最引人注目的領(lǐng)域當(dāng)屬利用CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的腫瘤的免疫治療(Chimeric?Antigen?Receptor?T-Cell?Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療)。2013年CAR-T治療被《科學(xué)》(Science)雜志評選為“十大科技進展”之首。CAR-T技術(shù)現(xiàn)階段主要用于血液腫瘤的治療，主要代表是FDA于2017年批準(zhǔn)的Kymriah(諾華)和Yescarta(Kite)兩款產(chǎn)品。

基因治療的流程一般是利用基因工程的方法將正常基因插入到病毒載體的DNA上；(2)將重組后的病毒DNA體外包裝產(chǎn)生具有感染能力的完整工程病毒；(3)把重組后的病毒直接注入病人體內(nèi)，病毒感染病變細(xì)胞并將正常基因帶到靶細(xì)胞中，實現(xiàn)疾病的治療；或者(1)將正常基因插入到病毒載體的DNA上；(2)將重組后的病毒DNA體外包裝產(chǎn)生具有感染能力的完整工程病毒；(3)獲取病人的體細(xì)胞，如造血干細(xì)胞等，體外培養(yǎng)擴增；(4)用重組后的病毒感染獲取的病人細(xì)胞，病毒把正常基因?qū)氚屑?xì)胞中；(5)對攜帶正常基因的重組細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增；(6)將攜帶正常基因的重組細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，實現(xiàn)疾病的治療。

以上無論哪種方法都會用到載體，目前使用的主要載體包括真核載體和病毒載體等，其中病毒載體的研究更加熱門，較常用的病毒載體包括腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可裝載DNA片段容量高達5kb，目的基因進入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，形成穩(wěn)定遺傳物質(zhì)，使得目的基因在細(xì)胞中可穩(wěn)定長期表達。腺病毒(adenovirus)顆粒沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，由252個殼粒呈二十面體排列構(gòu)成。每個殼粒的直徑為7～9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35000bp，兩端各有長約100bp的反向重復(fù)序列。腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進去，形成有感染能力的病毒顆粒，并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。逆轉(zhuǎn)錄病毒，球形，有包膜，80～120nm，含有逆轉(zhuǎn)錄酶的單鏈正鏈RNA病毒。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的亞科，逆轉(zhuǎn)錄病毒侵入宿主細(xì)胞后以自身RNA為模板，靠逆轉(zhuǎn)錄酶形成DNA環(huán)化后整合到宿主細(xì)胞的染色體中，以原病毒形式在宿主細(xì)胞中復(fù)制。

在使用病毒包裝核酸的時候，并不是所有的病毒都正確完成了包裝，往往存在損傷的、無感染能力的病毒，這些“無效”病毒會影響后續(xù)的應(yīng)用，因此病毒包裝效率的測定非常重要。在現(xiàn)有的檢測體系中，傳統(tǒng)的包裝效率檢測的方法有空斑檢測法、稀釋熒光計數(shù)法、定量PCR法、ELISA法(檢測P24蛋白含量)等，其中空斑檢測法為金標(biāo)準(zhǔn)，但是這些方法或者費時費力，或者成本高，無法實時反應(yīng)病毒包裝過程中的情況，嚴(yán)重影響了病毒的生產(chǎn)制造工藝的效率。因此，亟需一種可以簡單精確的用于病毒包裝效率檢測的方法。