[發明專利]人源化細胞因子IL3基因改造非人動物的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201911360460.4
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111118019B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 沈月雷;郭朝設;郭雅南;白陽;黃蕤;尚誠彰;張美玲;姚佳維
• 申請（專利權）人: 百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司;百奧賽圖（北京）醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/113;C07K19/00;C12N15/62;A01K67/027
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹;徐丹丹

1.一種人源化IL3基因改造非人動物的構建方法，其特征在于，所述的人源化IL3基因改造非人動物的基因組中包含嵌合IL3基因，所述的嵌合IL3基因中來源于人IL3基因的部分如SEQ ID NO：33所示，所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的人源化IL3基因改造非人動物體內表達人IL3蛋白，所述的非人動物為免疫缺陷的小鼠。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述的構建方法包括使用靶向IL3基因的sgRNA和/或靶向載體用編碼人IL3蛋白的核苷酸序列替換非人動物IL3基因的外顯子1至外顯子5的部分核苷酸序列，使得所述非人動物體內表達人IL3蛋白；

其中，所述的靶向載體包含供體DNA序列，其編碼供體轉換區，所述的供體DNA序列包含人IL3基因的部分核苷酸序列，所述的供體DNA序列如SEQ ID NO：33所示，所述的靶向載體包含與待改變的轉換區5’端同源的DNA片段，即5’臂，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的靶向載體包含與待改變的轉換區3’端同源的第二個DNA片段，即3’臂，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中，所述的待改變的轉換區位于IL3基因的外顯子1至外顯子5；

所述的sgRNA在待改變的IL3基因上的靶序列上是唯一的，所述sgRNA靶向5’端靶位點序列如SEQ ID NO：8所示，3’端靶位點序列如SEQ ID NO：20所示。

3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述的嵌合IL3基因編碼人IL3蛋白；所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列轉錄的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示。

4.一種IL3基因經遺傳修飾的小鼠細胞，其特征在于，所述的細胞中包含嵌合IL3基因，所述的嵌合IL3基因中來源于人IL3基因的部分如SEQ ID NO：33所示，所述細胞表達人IL3蛋白，所述的細胞不能發育為動物個體。

5.一種IL3基因的靶向載體，其特征在于，所述的靶向載體包含供體DNA序列，其編碼供體轉換區，所述的供體DNA序列包含人IL3基因的部分核苷酸序列，所述的供體DNA序列如SEQ ID NO：33所示，所述的靶向載體包含與待改變的轉換區5’端同源的DNA片段，即5’臂，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的靶向載體包含與待改變的轉換區3’端同源的第二個DNA片段，即3’臂，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中，所述的待改變的轉換區位于IL3基因的外顯子1至外顯子5。

6.一種特異的靶向IL3基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA在待改變的IL3基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgRNA在非人動物IL3基因的靶位點位于非人動物IL3基因的外顯子1和/或外顯子5上，所述sgRNA靶向5’端靶位點序列如SEQ ID NO：8所示，3’端靶位點序列如SEQ ID NO：20所示，所述的非人動物為免疫缺陷的小鼠。

7.一種制備多基因人源化非人動物的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（a）利用權利要求1-3任一所述的構建方法獲得非人動物；

（b）將步驟（a）制備獲得的非人動物與其他基因人源化動物交配、體外授精或直接進行基因編輯，并進行篩選，得到多基因人源化非人動物，所述的非人動物為免疫缺陷的小鼠。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的其他基因人源化動物選自基因IL6、IL15、CSF1、CSF2或SIPRA人源化動物中的一種或兩種以上的組合。

9.一種嵌合IL3基因，其特征在于，所述的嵌合IL3基因為人IL3基因的部分核苷酸序列與非人動物IL3基因的部分核苷酸序列的嵌合，所述的嵌合IL3基因編碼人IL3蛋白，所述的非人動物為免疫缺陷的小鼠，所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列選自下列組中的一種：

a）如SEQ ID NO：5所示；

b）轉錄的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示。

10.來源于權利要求1-3任一所述的構建方法獲得的人源化IL3基因改造非人動物、權利要求4所述的細胞或權利要求7-8任一所述的方法制備的多基因人源化非人動物在篩選、驗證、評價或研究IL3基因功能，在針對IL3靶位點的藥物的功能研究和/或構建疾病模型中的藥效研究中的應用，所述的應用為非疾病的診斷或者治療方法。