[發(fā)明專利]西番蓮內參基因PeNADP及其篩選方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911359463.6
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110951750B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發(fā)明（設計）人: 吳艷艷;楊行海;黃偉華;劉潔云;田青蘭;牟海飛
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C07K14/415;C12Q1/6895;G16B25/20;G16B30/20
• 代理公司: 廣西中知科創(chuàng)知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 林德利

本發(fā)明提供一種西番蓮內參基因PeNADP及其篩選方法和應用，屬于分子生物學領域。利用RNA?Seq測序數(shù)據(jù)分析表達量中度或高度、穩(wěn)定的基因作為候選內參基因，根據(jù)PeNADP的表達量值，選擇了2個表達量最高的基因和2個中高表達基因，并進行引物設計，然后在表型差異明顯的西番蓮品種的不同組織部位的mRNA中去驗證，利用軟件評估各個候選內參基因的表達穩(wěn)定性，最終篩選出適宜的西番蓮內參基因PeNADP。內參基因PeNADP在臺農一號和黃金果2號的莖、葉、花和果實中都能穩(wěn)定的表達。為后續(xù)西番蓮基因表達相關的科學研究提供了參考。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及一種西番蓮內參基因PeNADP及其篩選方法和應用。

背景技術

西番蓮是我國南方重要的果樹，其果實具有芳香氣味，富含糖類、維生素和礦質元素等物質，營養(yǎng)價值高、經濟效益好。西番蓮果汁中含有菠蘿、香蕉、草莓、蘋果、酸梅、芒果等165種水果香味，是舉世聞名的香料水果，果實中含有超過132種以上的芳香物質，有“果汁之王”的美譽。它的天然原汁以其自身鮮艷的色澤，獨特濃郁的芳香風味，豐富的營養(yǎng)以及對人體的保健作用，被稱為天然營養(yǎng)濃縮物和熱帶果后。西番蓮果實不僅營養(yǎng)價值高，生津止渴，還有防病健身的功效。據(jù)測定，西番蓮汁含有60多種揮發(fā)性化合物，可溶性固物含量高達10--14％，有機酸含量為1.5--3％。氨基酸含量也相當豐富，還含有多種維生素和礦物質元素。西番蓮種子含油量高達25％，可榨成食用油，油質與葵花油媲美。用它作原料，可加工成果汁、果露、果醬、果凍等產品，具有美容養(yǎng)顏、清暑開胃、消除疲勞、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降壓、防止動脈硬化等功效。

西番蓮中的應用逐漸受到重視，其分子生物學的研究也不斷深入和發(fā)展，基因表達分析也逐漸應用于揭示西番蓮基因表達和調控的機理。近年來，學者們已經逐步加快西番蓮基因組學、分子生物學、遺傳學等方面的研究。

基因行使功能就是從DNA到mRNA再到蛋白的一個過程，基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mRNA的多少來衡量的。因此，準確評估目標基因的表達量對研究其生物學功能意義重大。內參基因即內源性參照基因，其在生物的不同的細胞中表達相對穩(wěn)定。在基因研究過程中，RT-PCR、qRT-PCR等技術中都需要利用內參基因校正cDNA用量。常見的內參基因有β-actin、EF-1α、18S rRNA等。目前為止，尚未見西番蓮內參基因相關研究的報道。這嚴重制約了西番蓮重要性狀基因定位、克隆等研究進程。因此，在西番蓮中挖掘高度可信的內參基因十分必要。

發(fā)明內容

本發(fā)明的發(fā)明目的是，針對上述問題，提供一種西番蓮內參基因PeNADP，為后續(xù)西番蓮基因表達相關的科學研究提供了參考。

為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

西番蓮內參基因PeNADP，所述內參基因PeNADP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述內參基因PeNADP的PCR擴增引物核苷酸序列：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3所示。正向序列：TGAATTGGCACCCGGATGTT，反向序列：CAATCCAAGAGATCCGAAGCCT

還提供了一種西番蓮內參基因PeNADP的篩選方法，包括以下步驟：

S1、從數(shù)據(jù)庫選擇4個樣品數(shù)據(jù)，序列登錄號分別為：SRX4224487，SRX4224486，SRX4224485和SRX4224484，然后分別進行序列的組裝，預測序列的表達量分析，基因序列的功能注釋；最后計算所有西番蓮基因在4個樣品中表達量值的穩(wěn)定性，使用變異系數(shù)CV進行評估，選擇CV值小于0.2，且cDNA≥1000bp的基因作為候選內存基因。

S2、從候選內存基因中，PeNADP的表達量值，選擇了2個表達量最高的基因和2個中高表達基因。

S3、對步驟S2篩選的4個基因進行引物設計，并利用電泳評估引物的特異性。