[發明專利]西番蓮內參基因PeGBP及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201911356917.4
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110951749B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 吳艷艷;田青蘭;楊行海;黃偉華;劉潔云;牟海飛
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C07K14/415;C12Q1/6895;G16B25/20;G16B30/20
• 代理公司: 廣西中知科創知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 林德利

1.西番蓮內參基因PeGBP，其特征在于，所述內參基因PeGBP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP，其特征在于，所述內參基因PeGBP的PCR擴增引物核苷酸序列：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、從數據庫選擇4個樣品數據，序列登錄號分別為：SRX4224487，SRX4224486，SRX4224485和SRX4224484，然后分別進行序列的組裝，預測序列的表達量分析，基因序列的功能注釋；最后計算所有西番蓮基因在4個樣品中表達量值的穩定性，使用變異系數CV進行評估，選擇CV值小于0.2，且cDNA≥1000bp的基因作為候選內存基因；

S2、從候選內存基因中，PeGBP的表達量值，選擇了4個基因；

S3、對步驟S2篩選的4個基因進行引物設計，并利用電泳評估引物的特異性；

S4、提取紫果7號和黃果原生種的根、莖、葉、花和果實的總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，進行實時熒光定量PCR分析，計算Ct值，對步驟S2篩選的4個基因的表達穩定性進行分析；

S5、綜合確定最穩定表達的西番蓮內參基因PeGBP。

4.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，步驟S1中，從NCBI數據庫中下載所述4個樣品數據；使用Trinity軟件，參數min_kmer_cov 2進行序列的組裝；使用RSEM進行預測序列的表達量分析；使用BLAST和數據庫NR、COG、KOG，eggNOG、KEGG、GO、Pfam和Swiss-prot進行基因序列的功能注釋。

5.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，步驟S1中，從候選內存基因中，PeGBP的表達量值，選擇了2個表達量最高的基因和2個中高表達基因。

6.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，在步驟S3中，使用Primer3軟件進行針對篩選的4個序列進行引物設計。

7.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，在步驟S3中，西番蓮內參基因PeGBP的PCR擴增引物核苷酸序列：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，在步驟S4中，采用RNA提取試劑盒Ultrapure RNAKit提取紫果7號和黃果原生種的根、莖、葉、花和果實的總RNA，分別使用BioSpec-nano紫外可見分光光度計和1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和完整性。

9.根據權利要求1所述的西番蓮內參基因PeGBP的篩選方法，其特征在于，在步驟S4中，利用AnalytikJena qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀進行Ct計算，通過geNorm、NormFinder及BestKeepeer軟件對各候選內參基因的表達穩定性進行分析。

10.權利要求1所述的西番蓮內參基因在西番蓮基因表達分析中的應用。