[發明專利]一種酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法

有效

• 申請號: 201911356901.3
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111100904B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 常耀光;申晶晶;薛長湖;陳廣寧;張玉瑩;李嘉靖;薛勇;唐慶娟
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12N9/38;C12N15/56;G01N21/31
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1.一種酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：利用κ-卡拉膠酶特異性的將κ-卡拉膠降解為還原糖，將酶滅活后，加入對羥基苯甲酰肼溶液進行顯色反應，離心后測定上清液在400-420nm處的吸光值，對比標準曲線得到κ-卡拉膠含量；所述κ-卡拉膠酶為κ-卡拉膠酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1。

2.如權利要求1所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：所述κ-卡拉膠酶的最適反應溫度為25℃，最適反應pH值為8.0，且在pH 6.0-10.0的pH值范圍內基本保持穩定該酶具有良好的貯存穩定性，在4℃下可至少穩定貯存3個月；酶動力學常數Km為0.07mg/mL，Kcat為27.54s^-1，Km/Kcat為165.63μM^-1s^-1。

3.如權利要求1所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：編碼上述κ-卡拉膠酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2或可翻譯出SEQ ID NO.1的所有基因。

4.如權利要求1所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)κ-卡拉膠溶液的配制：稱取化學級或以上純度的κ-卡拉膠溶于緩沖液，制備具有濃度梯度的κ-卡拉膠標準溶液；

(2)pHBH溶液的配制：稱取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH調溶液pH至堿性，制備成10-100mg/mL的pHBH溶液；

(3)定量標準曲線的繪制：取步驟(1)配制的不同濃度κ-卡拉膠溶液分別與適量的κ-卡拉膠酶液混合進行反應；反應后使酶滅活；再加入pHBH溶液，進行顯色，迅速冷卻至室溫后離心取上清液，測定上清液的吸光值；將相同濃度梯度的κ-卡拉膠溶液與滅活酶液混合重復上述反應，測定其吸光值作為對照，然后計算出不同濃度κ-卡拉膠溶液所對應的吸光值增量；以κ-卡拉膠標準溶液濃度為橫坐標，以各濃度κ-卡拉膠的吸光值增量為縱坐標，通過線性擬合得出特定反應條件下的標準曲線；

(4)樣品測定：向樣品溶液中加入一定量κ-卡拉膠酶重復步驟(3)的反應；將吸光值增量代入相應加酶量、反應時間、反應溫度、反應pH等條件下的標準曲線，計算出反應體系中的κ-卡拉膠濃度，進而可得到樣品中的κ-卡拉膠含量。

5.如權利要求4所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：步驟(1)中的緩沖液pH為7.0-10.0。

6.如權利要求4所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：步驟(3)中酶的添加量為1-1000U，反應時間為5-40min，反應溫度為20-35℃。

7.如權利要求4所述的酶法定量檢測κ-卡拉膠的方法，其特征在于：步驟(4)測定前按照國標GB5009.88—2014方法，除去樣品中的還原糖。