[發明專利]生物堿cyanogramide的生物合成基因簇及其應用

有效

• 申請號: 201911356674.4
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111304225B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 張長生;朱義廣;張慶波;方春艷;張麗萍;馬亮;彭璟;朱偉明
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所;中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/53;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/465;C12R1/19
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了生物堿cyanogramide的生物合成基因簇及其應用。本發明的來源于放線菌A.cyanogriseus WH1?2216?6(保藏編號為：CCTCC NO:M 2009277)的cyanogramide生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的堿基序列所示，包含10個基因；其中的P450氧化酶基因cyaH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第10626～11843位的堿基序列的反向互補序列，編碼P450氧化酶CyaH，其能以Fdx、Fdr和NADPH為輔因子催化cyanogramide D通過骨架重排生成cyanogramide。本發明所提供的包含cyanogramide生物合成相關的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解cyanogramide家族天然產物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發明所提供的基因及其蛋白質也可以用來尋找和發現可用于醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。

技術領域：

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種氧化吲哚螺環生物堿類化合物cyanogramide的生物合成基因簇及其應用。

背景技術：

Cyanogramide(圖1中的1)是從一株淺藍異壁放線菌Actinoalloteichuscyanogriseus WH1-2216-6的培養物中分離得到，屬于生物堿類化合物，具有獨特的氧化吲哚螺環結構。Cyanogramide(1)具有逆轉腫瘤細胞抗性的活性，相應的機理正在深入研究中。

近十多年來發展起來的組合生物合成技術為改造復雜天然產物提供了新的思路和方法。在闡明了自然界的生物合成途徑、克隆和鑒定微生物天然產物生物合成基因簇的基礎上，采用組合生物合成技術對發現的生物合成基因進行缺失、重組和異源表達，不但能夠生產“非天然”的天然產物結構類似物，而且還可以提高天然產物的產量，或定向積累所需要的天然產物，為天然產物的發現和藥物開發提供分子和活性多樣性。

迄今為止，關于cyanogramide(1)生物合成基因簇克隆鑒定，構建重組菌株產生cyanogramide(1)及同系物，以及cyanogramide(1)結構中螺環的形成機制等國內外尚未見報道。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種生物堿類化合物cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其來源于淺藍異壁放線菌A.cyanogriseus WH1-2216-6。

本發明的cyanogramide(1)的生物合成基因簇，其特征在于，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第393～13440位的堿基序列所示，包含10個基因，具體為：

(1)負責β-咔啉堿骨架合成的基因，即cyaA、cyaB和cyaC共3個基因：

cyaA位于基因簇核苷酸序列第393-1946個堿基處，長度為1554個堿基對，編碼脂肪酸CoA連接酶，517個氨基酸；

cyaB位于基因簇核苷酸序列第3455-4399個堿基處，長度為945個堿基對，編碼Pictet–Spengler環化酶，314個氨基酸；

cyaC位于基因簇核苷酸序列第4420-6111個堿基處，長度為1692個堿基對，編碼脫羧酶，563個氨基酸；

(2)負責甲基化基因，即cyaD、cyaE和cyaF共3個基因：

cyaD位于基因簇核苷酸序列第6159-7190個堿基處，長度為1032個堿基對，編碼甲基轉移酶，343個氨基酸；

cyaE位于基因簇核苷酸序列第7226-8008個堿基處，長度為783個堿基對，編碼甲基轉移酶，260個氨基酸；

cyaF位于基因簇核苷酸序列第8583-9311個堿基處，長度為729個堿基對，編碼甲基轉移酶，242個氨基酸；