[發明專利]一種產賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201911355871.4
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111088203B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 應漢杰;柳東;雷鳴;陳勇;劉慶國;牛歡青
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種產賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法和應用，所所述的重組谷氨酸棒桿菌是通過在谷氨酸棒桿菌中過表達ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因glgC構建得到的；所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本發明通過在谷氨酸棒桿菌中過表達ADP葡萄糖焦磷酸化酶，提高了ADP葡萄糖焦磷酸化酶的活性，從而提高了谷氨酸棒桿菌糖原合成的速度。在發酵初期，糖原的合成使得谷氨酸棒桿菌得以快速響應高滲脅迫，從而提高了谷氨酸棒桿菌發酵初期的生長速度，并且提高了谷氨酸棒桿菌發酵產賴氨酸的產量，縮短了發酵周期。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及到一種產賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌。

背景技術

L-賴氨酸屬于天冬氨酸家族氨基酸，為人類和動物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，被廣泛用于飼料添加劑、食品強化劑和醫藥產品等方面，其中90％以上的賴氨酸產品用作飼料添加劑。

細菌中糖原生物合成的途徑是通過三種酶的作用進行的，即ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.27)，糖原合酶(EC 2.4.1.21)和分支酶(EC 2.4.1.18)，其分別對應由glgC，glgA和glgB基因編碼。該途徑的關鍵調控步驟是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的反應，該酶催化的反應為：

高滲脅迫是大規模氨基酸發酵的一個不利因素，盡管沒有糖原合成的谷氨酸棒桿菌細胞也能夠應對高滲條件，但是，糖原的合成能夠使谷氨酸棒桿菌快速適應高滲條件，從而更好地適應工業生產中發酵液過高的滲透壓，從而提高谷氨酸棒桿菌在發酵初期時的生長速度，最后提高發酵產量。因此，需要開發一種能夠有效促進糖原合成的重組谷氨酸棒桿菌。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種產賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌，以提高谷氨酸棒桿菌的賴氨酸產量，并且縮短發酵周期。

本發明還要解決的技術問題是，提供上述重組谷氨酸棒桿菌的構建方法。

本發明最后要解決的技術問題是，提供上述重組谷氨酸棒桿菌在發酵賴氨酸中的應用。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種產賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌，其中，所述的重組谷氨酸棒桿菌是通過在谷氨酸棒桿菌中過表達ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因glgC構建得到的。

其中，所述ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因glgC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述谷氨酸棒桿菌為ATCC13032。

其中，所述的過表達ADP葡萄糖焦磷酸化酶是指通過在表達載體上導入ADP葡萄糖焦磷酸化酶glgC基因序列，提高ADP葡萄糖焦磷酸化酶的拷貝數，從而增強ADP葡萄糖焦磷酸化酶的活性。

上述重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)對谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組進行PCR，擴增glgC基因，得到glgC基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)將步驟(1)得到的glgC基因片段克隆到過表達質粒上，得到重組質粒pXMJ19*glgC；

(3)將步驟(2)得到的重組質粒導入谷氨酸棒桿菌中，篩選得到過重組谷氨酸棒桿菌；

步驟(1)中，擴增glgC基因設計的引物的序列如下：引物1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

步驟(1)中，所述PCR擴增的方法為：94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，進行30個循環。

步驟(2)中，所述的過表達質粒為pXMJ19。